豬暴發(fā)性肝衰竭動(dòng)物模型的建立及研究應(yīng)用.pdf

1、背景及目的:
　　 乙型肝炎病毒感染在發(fā)展中國(guó)家和亞太地區(qū)非常嚴(yán)重，我國(guó)是乙型肝炎病毒感染高發(fā)地區(qū)，人群攜帶率約10～15[％]。在我國(guó)，由乙型肝炎病毒引起的暴發(fā)性肝衰竭約占暴發(fā)性肝衰竭病因中的70～80[％]，嚴(yán)重威脅了人民的身體健康，亦給社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)。暴發(fā)性肝衰竭是指患者在兩周內(nèi)發(fā)生大量肝細(xì)胞壞死而出現(xiàn)以肝功能嚴(yán)重受損或/和以肝性腦病為主要特征的綜合征。該疾病發(fā)病兇險(xiǎn)，進(jìn)展迅速，目前臨床缺乏特異、有效的治療手段，

2、致病死率高達(dá) 80～90％。暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)病機(jī)理尚不十分明確，其中有研究表明暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)病與肝細(xì)胞凋亡有重要聯(lián)系。近年來(lái)本研究組在重型乙型肝炎患者和小鼠暴發(fā)性肝衰竭模型的實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)纖維介素(fgl2)與早期肝細(xì)胞壞死及疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。Fgl2凝血酶原酶(簡(jiǎn)稱fgl2)蛋白為纖維蛋白家族中的一員，由活化的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，具有凝血酶原酶的活力，能夠催化凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，啟動(dòng)凝血過(guò)程，促進(jìn)微血栓的形

3、成，加重肝細(xì)胞缺血缺氧，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞大量壞死，出現(xiàn)暴發(fā)性肝衰竭。由于暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，加之現(xiàn)有技術(shù)手段難以實(shí)現(xiàn)乙型肝炎病毒的體外培養(yǎng)，因此建立一個(gè)穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型對(duì)于暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)病機(jī)制的研究和藥物評(píng)價(jià)尤為重要。現(xiàn)有的暴發(fā)性肝衰竭模型主要局限于小動(dòng)物模型，如寧琴等利用鼠肝炎病毒3型(Mouse hepatitis virus MHV-3)感染Balb/c小鼠建立的毒株依賴性暴發(fā)性肝衰竭模型；邱英鋒等聯(lián)合卡介苗(BCG)和

4、脂多糖(LPS) 誘導(dǎo) Sprague Dawley(SD) 大鼠建立的急性免疫性肝損傷模型；以及賴力英等利用四氯化碳誘導(dǎo)大鼠建立的急性肝功能衰竭動(dòng)物模型。小動(dòng)物模型雖然具有來(lái)源簡(jiǎn)單，易于推廣應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)，但其體積大小及解剖學(xué)特點(diǎn)決定了其難以應(yīng)用于暴發(fā)性肝衰竭治療藥物的臨床前安全性評(píng)價(jià)和療效評(píng)價(jià)，建立肝臟解剖和生理生化指標(biāo)更接近人的大動(dòng)物模型則可以實(shí)現(xiàn)基礎(chǔ)和臨床之間的過(guò)渡。
　　 本研究具體研究目標(biāo)如下：
　　 1.建立一

5、個(gè)模擬人類疾病進(jìn)程的豬暴發(fā)性肝衰竭模型，用于暴發(fā)性肝衰竭治療藥物的臨床前安全性評(píng)價(jià)及療效評(píng)價(jià)；
　　 2.檢測(cè)模型肝組織中fgl2凝血酶原酶(纖維介素)的表達(dá)情況，為針對(duì)fgl2的基因治療提供基礎(chǔ)和依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.使用D-氨基半乳糖鹽酸鹽誘導(dǎo)豬暴發(fā)性肝衰竭模型,分為造模組(耳靜脈快速注射D-氨基半乳糖鹽酸鹽，劑量為1.2g/kg)和陰性對(duì)照組(予以5％葡萄糖)給藥。觀察兩組動(dòng)物臨床表現(xiàn)、肝臟功能生

6、化指標(biāo)和組織病理學(xué)改變；
　　 2.Realtime PCR檢測(cè)肝組織中豬fgl2(pfgl2)mRNA水平的表達(dá)，免疫組化檢測(cè)肝組織中pfgl2蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功建立了與人在臨床表現(xiàn)、肝臟生化指標(biāo)、組織病理學(xué)改變相似的豬暴發(fā)型肝衰竭模型：
　　 1.1生存時(shí)間：注射D-氨基半乳糖鹽酸鹽的造模組3頭豬全部于72h死亡；對(duì)照組3頭健康存活；
　　 1.2神經(jīng)系統(tǒng)變化：①疼痛刺

7、激反應(yīng)：造模組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在48h開(kāi)始出現(xiàn)疼痛刺激反應(yīng)遲鈍，并逐漸加重；②肌強(qiáng)直：造模組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在48h開(kāi)始出現(xiàn)站立不穩(wěn)，并在60h不能站立；③昏迷：造模組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在48h出現(xiàn)嗜睡，在60-72h出現(xiàn)淺昏迷；對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)明顯變化。
　　 1.3肝臟功能生化檢測(cè)結(jié)果：造模組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、一分鐘膽紅素、凝血酶原時(shí)間、血氨分別在24h開(kāi)始上升，并在72h達(dá)到高峰；白蛋白、凝血酶原活動(dòng)度分別在24h開(kāi)始下降，并在72h達(dá)

8、到最低；對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝臟功能生化檢測(cè)未見(jiàn)明顯變化。
　　 1.4組織病理學(xué)變化：造模組尸檢可見(jiàn)肝臟體積增大、腫脹，表面有大量出血點(diǎn)。造模組肝臟組織石蠟切片，常規(guī) HE 染色觀察可見(jiàn)肝細(xì)胞大量壞死、肝索破壞明顯，有大量的出血和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。胃腸粘膜上皮細(xì)胞可見(jiàn)少量壞死脫落，余臟器未見(jiàn)明顯病變。對(duì)照組組織病理學(xué)檢查未見(jiàn)異常。
　　 2.fgl2在豬暴發(fā)型肝衰竭模型肝組織中的表達(dá)：
　　 2.1通過(guò)realtime

9、 PCR檢測(cè)pfgl2在肝臟的mRNA水平，結(jié)果顯示pfgl2在豬暴發(fā)性肝衰竭模型的肝組織中的pfgl2 mRNA表達(dá)水平較陰性對(duì)照組明顯增高；
　　 2.2用兔源性fgl2 多克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示豬暴發(fā)性肝衰竭模型的肝組織中有明顯的fgl2 蛋白的表達(dá)，表達(dá)細(xì)胞為肝細(xì)胞壞死區(qū)域的肝細(xì)胞、炎性浸潤(rùn)細(xì)胞、肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞,陽(yáng)性棕染區(qū)域主要位于胞膜和胞漿；陰性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織未見(jiàn)fgl2陽(yáng)性著色。<

10、br>　　 結(jié)論:
　　 1.以D-氨基半乳糖鹽酸鹽誘導(dǎo)的豬暴發(fā)性肝衰竭模型可以很好地模擬人類暴發(fā)性肝衰竭病理過(guò)程，為探討暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)病機(jī)制和治療策略提供了有力的工具，是可用于評(píng)價(jià)暴發(fā)性肝衰竭治療藥物的臨床前療效及安全性的理想的大動(dòng)物模型。
　　 2.Pfgl2在豬暴發(fā)性肝衰竭動(dòng)物模型的肝組織中有mRNA水平和蛋白水平的異常高表達(dá)，提示pfgl2誘導(dǎo)的凝血途徑亦參與了暴發(fā)性肝衰竭肝細(xì)胞壞死的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，針對(duì)fgl