新型乙型肝炎病毒細(xì)胞感染模型的建立.pdf

1、研究背景
　　 乙型肝炎病毒感染是全球范圍內(nèi)影響人類健康的重大問(wèn)題，我國(guó)是乙型肝炎高流行地區(qū)，全國(guó)一般人群HBsAg陽(yáng)性率為9.09％，估計(jì)約1.2億人為慢性HBV感染，占全世界慢性HBV感染人數(shù)的1/3[1]。目前人們對(duì)HBV及其所致疾病有了相當(dāng)深入的認(rèn)識(shí)，但由于缺乏合適的動(dòng)物模型及體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，乙型肝炎病毒的生物學(xué)研究和治療進(jìn)展緩慢[2-6]。現(xiàn)有用于研究HBV的細(xì)胞模型主要是人原代肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系，前者保留了分化肝細(xì)

2、胞的重要細(xì)胞學(xué)特性，但其缺陷在于在體外培養(yǎng)幾天后開始出現(xiàn)肝細(xì)胞特殊形態(tài)的消失，并且失去了對(duì)HBV的感染和復(fù)制能力，因而限制了其應(yīng)用；而后者是通過(guò)轉(zhuǎn)染HBV基因組或添加化學(xué)試劑而非HBV自然感染的方式進(jìn)入到細(xì)胞中，因此不能用于HBV早期感染過(guò)程的研究。為此，本研究旨在通過(guò)將經(jīng)化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)產(chǎn)生次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)基因突變的HepG2細(xì)胞與未攜帶HBV的人原代肝細(xì)胞融合建立一新型細(xì)胞系，使其能夠自然感染HBV并能體外傳

3、代培養(yǎng)，為HBV感染宿主細(xì)胞的早期機(jī)制的研究，以及病毒侵入人肝細(xì)胞后完整的復(fù)制過(guò)程的研究提供一個(gè)強(qiáng)有力的工具。
　　 目的
　　 建立一新型細(xì)胞株，使該細(xì)胞株既能自然感染HBV又能傳代培養(yǎng)，評(píng)價(jià)雜交細(xì)胞對(duì)HBV的自然感染能力。
　　 方法：
　　 分離培養(yǎng)未攜帶HBV的人原代肝細(xì)胞，與誘導(dǎo)突變的HepG2細(xì)胞進(jìn)行融合得雜交細(xì)胞，經(jīng)HAT培養(yǎng)基篩選，利用胰蛋白酶G顯帶技術(shù)鑒定所得細(xì)胞，用含HBV的慢性乙型肝

4、炎患者血清感染雜交細(xì)胞（同時(shí)感染HepG2作為對(duì)照），巢式PCR檢測(cè)感染后細(xì)胞內(nèi)HBVDNA合成及分泌情況及有無(wú)HBV復(fù)制中間產(chǎn)物HBVcccDNA，間接免疫熒光檢測(cè)感染后細(xì)胞內(nèi)HBcAg的表達(dá)，電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)感染后細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBsAg和HBeAg。
　　 結(jié)果：
　　 成功建立人原代肝細(xì)胞與HepG2的雜交細(xì)胞，能體外傳代培養(yǎng)，染色體核型分析示雜交細(xì)胞染色體眾數(shù)為99條，證實(shí)為融合細(xì)胞，HBV感染后第4天起，雜

5、交細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)上清中均能檢測(cè)到HBVDNA，HBV感染后第3天起，雜交細(xì)胞內(nèi)可以檢測(cè)到HBV的復(fù)制中間產(chǎn)物HBVcccDNA，HBV感染后第4天起，雜交細(xì)胞胞漿及部分胞核內(nèi)HBcAg始終是陽(yáng)性表達(dá)，間接免疫熒光染色呈胞漿彌漫性著色，電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)培養(yǎng)上清中HBsAg及HBeAg持續(xù)表達(dá)；而感染后的HepG2細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果均為陰性。
　　 結(jié)論：
　　 成功建立了一個(gè)兼具有人原代肝細(xì)胞和HepG2細(xì)胞遺傳特性的雜交細(xì)胞株，