實時熒光PCR技術檢測乙型肝炎病毒YMDD變異和乙型肝炎病毒基因型方法的建立及應用.pdf

1、實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)是近年來興起的、已經(jīng)成為分子生物學重要技術之一。實時熒光定量PCR是指在PCR體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR過程，最后通過標準曲線來對未知模板進行定量分析的方法。借助熒光信號來檢測PCR產(chǎn)物，一方面提高了靈敏度，另一方面可以在每次PCR循環(huán)收集數(shù)據(jù)，建立實時擴增曲線，準確地確定域值循環(huán)數(shù)(CT值)，計算起始拷貝數(shù)，做到了真正意義上的DNA定

2、量。由于PCR的擴增和產(chǎn)物分析過程都在一封閉的管中進行，較之傳統(tǒng)的PCR方法大大減少了污染的幾率，因此熒光定量PCR具有特異、快速、敏感、準確、線性范圍寬，操作簡便安全，且無PCR后處理。該方法又根據(jù)熒光標記的不同，分為熒光染料法和熒光探針法。熒光探針法又根據(jù)探針設計的不同原理分為5'核酸酶探針(5'Nuclease(TaqMan)Probes)，分子信標(molecular beacon)和FRET雜交探針(FRET hybridiz

3、ationprobe)。TaqMan探針的實時熒光定量PCR是本課題的主要研究對象，本論文報道應用選擇引物的原理建立TaqMan探針的實時熒光定量PCR方法用于LAM治療HBV過程中的YMDD變異的點突變監(jiān)測以及TaqMan探針的實時熒光定量PCR方法用于乙型病毒基因型的檢測。 第一部分選擇引物的TaqMan探針的實時熒光定量PCR用于LAM療HBV過程中的YMDD變異的點突變監(jiān)測方法建立拉米夫定(Lamivudine，LAM)

4、是目前公認的最有效而安全的抗病毒的核苷類似藥物，但長期使用可誘發(fā)HBV病毒變異，引起病毒耐藥。酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)功能區(qū)變異是HBV拉米夫定耐藥的主要原因。 近年來國內外學者采用許多方法進行YMDD變異，如測序、線性探針分析[6]、基因芯片[7]、PCR-肽核酸[8]、聚合酶鏈反應限制性片段長度多態(tài)性[9]，和通用模板PCR[10]等方法。鑒于我國醫(yī)療機構實驗室開展實時熒光PCR檢測十分普遍，這些實驗

5、室都擁有熒光定量PCR分析儀，故此本文針對該類儀器，采用選擇性引物和TaqMan探針技術，建立了一種新的適應這類設備的實時熒光PCR方法。我們用此方法檢測187例臨床乙肝患者血清標本，觀察HBV的YMDD變異情況，同時用測序法作為金標準比對驗證。結果證明，此方法在臨床YMDD變異診斷中具有快速、靈敏和特異的特點。第二部分應用TaqMan探針的實時熒光定量PCR方法用于乙型肝炎病毒基因型的檢測應用TaqMan探針的實時熒光定量PCR方法對

6、150例HBV樣本進行HBVDNA定量檢測和分型檢測，然后對其中載毒量大于5000IU/ml的113例標本和一例進行測序分型檢測。對于通過PCR測序方式獲得的114例樣本的DNA序列，全部使用NCBI在線分型工具(www.ncbi.nlm.ni.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)進行DNA序列的比對、分析.進行HBV基因分型。驗證了該方法能快速對乙型肝炎病毒B基因型、C基因型以及B、C混合基因型進