避免乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒核酸漏檢的新型實(shí)時(shí)熒光PCR方法的研究及其內(nèi)標(biāo)的建立.pdf

1、第一部分避免乙型肝炎病毒核酸漏檢的新型實(shí)時(shí)熒光PCR方法的研究及其內(nèi)標(biāo)的建立
　　 目的：
　　 建立避免乙型肝炎病毒核酸漏檢的新型雙重實(shí)時(shí)熒光PCR測定方法，最大限度的避免乙型肝炎病毒感染者的漏檢；同時(shí)制備對人無生物傳染性、穩(wěn)定的、耐DNase和RNase的、防止假陰性結(jié)果的內(nèi)標(biāo)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠。
　　 方法：
　　 我們從美國Los Alamos國家實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)站和NCBI網(wǎng)站上下載所有的HBV序列，

2、采用序列比對軟件DNAMAN進(jìn)行分析，查找保守區(qū)域。然后針對保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，初步建立實(shí)時(shí)熒光PCR檢測體系。
　　 我們按照引物探針設(shè)計(jì)的基本原則，針對HBV基因組的保守區(qū)域設(shè)計(jì)許多組備選的引物探針，將那些能互補(bǔ)的檢測所有類型HBV的引物探針兩兩組合，對一些HBV陽性樣本進(jìn)行檢測，看能否起到檢測能力增強(qiáng)的作用，選出最佳的2組引物探針組合，初步建立雙引物雙探針檢測體系。
　　 根據(jù)前面篩選出的最佳探針序列在HBV基

3、因組中的位置，采用重疊延伸PCR技術(shù)將原來的檢測探針結(jié)合區(qū)突變?yōu)閮?nèi)標(biāo)探針結(jié)合區(qū)。為了使內(nèi)標(biāo)更加穩(wěn)定，我們根據(jù)lambda噬菌體的克隆步驟使用了lambda噬菌體gt11載體和EcoRI的限制性酶切位點(diǎn)，采用體外包裝技術(shù)構(gòu)建了耐DNase酶和RNase酶的噬菌體內(nèi)標(biāo)，然后通過棋盤法確定了內(nèi)標(biāo)噬菌體在雙引物雙探針檢測體系中的最佳摻入量。
　　 我們使用雙引物雙探針檢測體系對不同濃度的HBV DNA國際標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了檢測，并采用上述構(gòu)建

4、的噬菌體作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行假陰性質(zhì)控，考察了所建立方法的檢測下限和特異性。通過大量臨床樣本，比較了單引物單探針、雙引物雙探針以及國內(nèi)一些商品試劑盒的檢測能力和臨床適用性。
　　 結(jié)果：
　　 通過大量臨床樣本的篩選，最終建立了檢測性能最好的雙引物雙探針檢測體系。成功的使用Lambda噬菌體包裝技術(shù)構(gòu)建了耐DNase和RNase的、對人無生物傳染危險(xiǎn)性的噬菌體，經(jīng)過棋盤法篩選后，采用1000copies/ml的噬菌體顆粒作為防止

5、假陰性結(jié)果的內(nèi)標(biāo)。
　　 本研究建立的雙引物雙探針體系的檢測下限為29.5IU/ml，檢測特異性為100％，檢測線性R=0.993。在對69份臨床樣本的檢測中發(fā)現(xiàn)雙引物雙探針體系的檢測能力與羅氏公司的COBAS AmpliPrcp（CAP）/COBAS TaqMan（CTM）HBV檢測結(jié)果一致，明顯優(yōu)于單引物單探針檢測以及國產(chǎn)HBV熒光定量檢測試劑盒（上?？迫AHBV熒光定量檢測試劑盒）。
　　 結(jié)論：
　　 本研

6、究建立的雙引物雙探針檢測HBV DNA實(shí)時(shí)熒光PCR方法的檢測下限為29.5 IU/ml，特異性為100％，檢測線性R=0.993。在對臨床樣本的檢測中證明具有很好的臨床適用性，并且成本要低于羅氏公司的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒，適于大規(guī)模的推廣以及在發(fā)展中國家中應(yīng)用。
　　 本研究采用的Lambda噬菌體包裝系統(tǒng)可以作為構(gòu)建armored DNA的較好平臺(tái)。此方法制備的armored DNA具有穩(wěn)定性好、DNase酶抗性以及對人

7、無生物傳染危險(xiǎn)性等優(yōu)點(diǎn)，可以作為內(nèi)標(biāo)對HBV DNA檢測的全過程進(jìn)行監(jiān)測，防止假陰性結(jié)果的發(fā)生。
　　 第二部分避免丙型肝炎病毒核酸漏檢的新型實(shí)時(shí)熒光PCR方法的研究及其內(nèi)標(biāo)的建立
　　 目的：
　　 建立避免丙型肝炎病毒核酸漏檢的新型雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法，最大限度的避免丙型肝炎病毒感染者的漏檢；同時(shí)制備無生物傳染性、穩(wěn)定的、耐DNase和RNase的、防止假陰性結(jié)果的內(nèi)標(biāo)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠。

8、>　　 方法：
　　 為了能精確的顯示HCV基因組的保守區(qū)域，我們從美國Los Alamos國家實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)站和NCBI網(wǎng)站上下載所有的HCV序列，采用序列比對軟件DNAMAN進(jìn)行分析，查找保守區(qū)域。然后針對保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，初步建立實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測體系。
　　 我們按照引物探針設(shè)計(jì)的基本原則，針對HCV基因組的保守區(qū)域（5’UTR）設(shè)計(jì)許多組備選的引物探針，將那些能互補(bǔ)的檢測所有HCV基因型和亞型的引物探針

9、兩兩組合，通過對一些臨床HCV陽性樣本檢測，看能否起到檢測能力增強(qiáng)的作用，選出最佳的2組引物探針組合，初步建立雙引物雙探針檢測體系。根據(jù)篩選出的最佳探針序列在HCV基因組中的位置，采用重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒，利用MS2噬菌體蛋白質(zhì)和基因組RNA相互作用的機(jī)制及噬菌體衣殼蛋白空間構(gòu)象的特點(diǎn)進(jìn)行噬菌體顆粒的包裝，表達(dá)出內(nèi)含HCV RNA的內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒，并使用不同濃度的內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒分別摻入到高、中、低濃度的HCV血清中進(jìn)行擴(kuò)增，確

10、定內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒在反應(yīng)中的最佳濃度。
　　 我們使用雙引物雙探針檢測體系對不同濃度的HCV RNA國際標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了檢測，并采用內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒進(jìn)行假陰性質(zhì)控，考察了所建立方法的檢測下限和特異性。通過大量臨床樣本，比較了單引物單探針、雙引物雙探針以及國內(nèi)、國際一些商品試劑盒的檢測能力和臨床適用性。
　　 結(jié)果：
　　 通過大量臨床樣本的篩選，最終建立了檢測性能最好的雙引物雙探針檢測體系。成功的使用1000copies

11、/ml的病毒樣顆粒作為防止假陰性結(jié)果的內(nèi)標(biāo)，建立的雙引物雙探針體系的檢測下線為38.99 IU/ml，檢測特異性為100％，檢測線性R=0.998。在對深圳市血液中心的109份血清樣本的檢測中發(fā)現(xiàn)雙引物雙探針體系的檢測結(jié)果與羅氏公司的COBAS AmpliPrep（CAP）/COBAS TaqMan（CTM）檢測結(jié)果一致，明顯優(yōu)于兩種國產(chǎn)HCV熒光定量檢測試劑盒（上海科華HCV熒光定量檢測試劑盒和杭州博日HCV熒光定量檢測試劑盒）。

12、r>　　 結(jié)論：
　　 本研究建立的雙引物雙探針檢測HCV RNA實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的檢測下限為38.99 IU/ml，檢測特異性為100％，檢測線形R=0.998，并能檢測出所有的HCV基因型。在對臨床樣本的檢測中證明具有很好的臨床適用性，并且雙引物雙探針檢測體系的成本要低于羅氏公司的CAP/CTM試劑盒，更適于大規(guī)模的推廣以及在發(fā)展中國家中應(yīng)用。
　　 本研究制備的armored RNA具有穩(wěn)定性好、DNas