乙型肝炎病毒基因型及變異與慢加急性肝衰竭的關(guān)系.pdf

1、背景:
　　 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染引起的疾病譜比較廣泛,從無(wú)癥狀攜帶到暴發(fā)性肝衰竭、慢性肝炎(chromc hepatitis B,CHB)、肝硬化以及肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。慢加急性肝衰竭(Acute-on-chronic liverfailure,ACLF)是在慢性肝病基礎(chǔ)上出現(xiàn)的病情急性加重、臨床表現(xiàn)多樣而且死亡率較高的疾病,按照亞太肝病學(xué)

2、會(huì)最新的定義,ACLF是指“之前已診斷或尚未診斷的慢性肝病基礎(chǔ)上,患者以黃疸和凝血功能障礙為臨床表現(xiàn)的急性肝臟損害,發(fā)病4周內(nèi)合并腹水和/或者肝性腦病”。
　　 在我國(guó),HBV感染是引起ACLF發(fā)生主要原因,但其發(fā)生機(jī)理仍不明確,一般認(rèn)為,病毒變異和宿主的免疫反應(yīng)都與ACLF的發(fā)生相關(guān)。調(diào)查發(fā)現(xiàn),前C基因區(qū)的G1896A變異和C基因啟動(dòng)子區(qū)的A1762T/G1764A變異都與暴發(fā)性肝炎的發(fā)生相關(guān),其它位點(diǎn)的變異包括前C/C基因啟

3、動(dòng)子區(qū)的T1753V(C/A/G),T1754V(C/A/G)以及G1862A變異與暴發(fā)性肝炎的相關(guān)性也有報(bào)道。這些變異可能通過(guò)增強(qiáng)HBV的復(fù)制能力或下調(diào)HBeAg的表達(dá)而導(dǎo)致重癥肝炎的發(fā)生,但是來(lái)自亞洲以及歐洲地區(qū)幾項(xiàng)小樣本量的調(diào)查未發(fā)現(xiàn)HBV前C/C基因啟動(dòng)子區(qū)的G1896A或A1762T/G1764A雙變異與暴發(fā)性肝炎的發(fā)生相關(guān)。在HBV基因型與肝衰竭發(fā)生的相關(guān)性方面,來(lái)自日本的幾項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn),Bj基因亞型與暴發(fā)性肝炎的發(fā)生相關(guān)。在

4、HBV基因型及變異與ACLF發(fā)生的相關(guān)性方面,來(lái)自國(guó)內(nèi)的一項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn),基因型B以及T1753V、A1762T、G1764A、G1896A、G1899A單點(diǎn)變異以及T1753V/A1762T/G1764A和A1762T/G1764A/C1766T(或T1768A)三聯(lián)變異在ACLF患者中的流行率更高。由于ACLF患者死亡率高,臨床缺乏有效的治療手段,特別是缺乏早期的預(yù)警疾病發(fā)生的指標(biāo),因此尋找與ACLF發(fā)生相關(guān)的早期預(yù)警指標(biāo),進(jìn)行早期干預(yù)

5、、早期治療,對(duì)于提高療效,降低發(fā)病率和病死率都具有非常重要的意義。
　　 另外在HBV相關(guān)HCC的研究中發(fā)現(xiàn),基因型C以及T1753V、A1762T/G1764A變異與HCC發(fā)生密切相關(guān),能夠增加HCC發(fā)生的危險(xiǎn)性,而G1896A變異與HCC的發(fā)生相關(guān)性不大。ACLF是在慢性肝病基礎(chǔ)上出現(xiàn)的肝細(xì)胞大塊或亞大塊壞死,而大部分HCC的發(fā)生則是慢性肝病在不斷經(jīng)歷炎癥的基礎(chǔ)上進(jìn)展為肝硬化、再進(jìn)一步進(jìn)展為HCC,兩種疾病的發(fā)生機(jī)理不同,H

6、BV基因型和變異在這兩種疾病中的發(fā)生率和所起的作用有待闡明。
　　 目的:
　　 通過(guò)與CHB及HCC患者比較,進(jìn)一步明確與ACLF發(fā)生相關(guān)的HBV基因型以及前C/C基因啟動(dòng)子區(qū)的變異位點(diǎn),尋找ACLF發(fā)生的早期預(yù)警指標(biāo),為早期診斷、早期治療提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 本研究共納入慢性HBV感染者309例,其中ACLF患者76例,CHB患者124例,HCC患者109例,所有病例均來(lái)自廣東地區(qū)。ACLF

7、診斷是在慢性肝病的基礎(chǔ)上急性起病,血清總蛋紅素>171μmol/L,凝血酶原活動(dòng)度(PTA)≤40％,并伴有相關(guān)合并癥；CHB的診斷按照臨床檢查和肝功能檢測(cè)結(jié)果確診；HCC的診斷經(jīng)超聲和CT檢查確診,所有患者均排除有丙、丁、戊型肝炎病毒的感染。血清標(biāo)志物檢測(cè)采用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行,肝功能檢測(cè)包括轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)、總蛋紅素(TBIL)等。抽提血清中的HBV DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,首先擴(kuò)增HBV的S基因區(qū)進(jìn)行基因型和亞型的分析

8、,擴(kuò)增引物為BS1和Pol2,如果第一輪PCR為陰性,用引物BS1和P29進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,再用ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定。前C/C基因啟動(dòng)子區(qū)的擴(kuò)增用引物Is2-2和P30A進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增,用引物Is2-2和HC24R進(jìn)行第二輪擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,再用ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果用Lasergene software suite V6.0,DNASTAR處理,

9、用CLUSTALW1.8對(duì)序列進(jìn)行排列比對(duì),并與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中的A-G7種HBV基因型參考序列進(jìn)行比較,進(jìn)化樹(shù)分析用MEGA4.0。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1)ACLF與CHB相比,兩組患者的年齡和性別比較差異無(wú)顯著性,ACLF患者中的ALT(581±586 vs220±312,P<0.001)、AST(493±699 vs1

10、45±215,P<0.001)以及TBIL(424±216 vs33±59,P<0.001)水平均顯著高于CHB患者組,而ALB水平則顯著低于CHB組(32.3±5.4 vs43.1±6.3,P<0.001),ACLF組HBeAg的陽(yáng)性率顯著低于CHB組(28.9％vs59.7％,P<0.001)。
　　 2)ACLF與HCC相比,兩組患者的性別比較無(wú)顯著差異,HCC患者組的平均年齡顯著高于ACLF組(51.5±11.4vs38

11、.0±11.1,P<0.001)。與CHB患者組類似,ACLF患者的平均ALT(581±586 vs66±57,P<0.001)、AST(493±699vs75±68,P<0.001)以及TBIL(424±216 vs37±69,P<0.001)水平均顯著高于HCC患者,而ALB水平則顯著低于HCC組(32.3±5.4 vs39.5±4.7,P<0.001),HCC組的HBeAg陽(yáng)性率顯著低于ACLF組(13.8％vs28.9％,P=0

12、.011)。
　　 3)基因型及亞型總體分布:在納入的309例患者中,感染B基因型毒株的患者共190(61.5％)例,感染C基因型毒株的患者共119(38.5％)例。經(jīng)序列比對(duì)分析證實(shí),所有B基因型毒株均為B2亞型,未發(fā)現(xiàn)其它B基因亞型的存在；119例C基因型感染者中,C1亞型感染者88(73.9％)例,C2亞型感染者31(26.1％)例,C1亞型的流行率高于C2亞型。
　　 4)三組患者中基因型及亞型分布:在76例AC

13、LF患者中,感染B基因型毒株的患者共70(92.1％)例,感染C基因型毒株的患者共6(7.9％)例,其中
　　 C1亞型4(66.7％)例,C2亞型2(33.3％)例；在124例CHB患者中,B基因型毒株感染者共75(60.5％)例,C基因型毒株感染者共49(39.5％)例,其中C1亞型31(63.3％)例,C2亞型18(36.7％)例；在109例HCC患者中感染B基因型毒株的患者共45(41.3％)例,感染C基因型毒株的患者共

14、64(58.7％)例,其中C1亞型感染者53(82.8％)例,C2亞型感染者11(17.2％)例,HBV基因型的分布在三組病例間有顯著性差異(P<0.001),ACLF患者中基因型B的流行率高,而HCC患者中C基因型的流行率高?；蛐虰比C的差異ACLF與CHB相比,x2=23.632,P<0.001；ACLF與HCC相比,x2=49.17,P<0.001；HCC與CHB相比,x2=8.561,P=0.003。C1和C2兩種C基因亞型在

15、三組病例間的分布無(wú)顯著性差異。
　　 5)HBV前C/C基因啟動(dòng)子區(qū)變異在ACLF和CHB兩組患者間的發(fā)生率對(duì)比,變異的發(fā)生主要以A1762T/G1764A、A1846T和G1896A四個(gè)位點(diǎn)為主,變異發(fā)生率較高,其余六個(gè)位點(diǎn)T1753V、C1766T、T1768A、G1862T、G1898A和G1899A變異的發(fā)生率均較低。T1753V變異在CHB患者中的發(fā)生率顯著高于ACLF組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.9％vs13.7％,P=

16、0.029);A1846T(56.6％vs21.0％,P<0.001)、G1896A(64.5％vs29.0％,P<0.001)兩個(gè)位點(diǎn)的變異在ACLF組的發(fā)生率則顯著高于CHB組；而A1762T/G1764A、C1766T、T1768A、G1862T、G1898A和G1899A七個(gè)位點(diǎn)變異的發(fā)發(fā)生率在兩組病例間無(wú)顯著性差異。
　　 6)HBV前C/C基因啟動(dòng)子區(qū)變異在ACLF和HCC兩組患者間的發(fā)生率對(duì)比,T1753V和A17

17、62T/G1764A變異在HCC患者中的發(fā)生率顯著高于ACLF組(分別為:43.1％vs3.9％,P<0.001；78.9％vs52.6％,P<0.001);G1896A變異在ACLF患者中的發(fā)生率則顯著高于HCC患者組(64.5％vs36.7％,P<0.001);A1846T變異在ACLF和HCC患者中的發(fā)生率都較高,但兩組間差異無(wú)顯著性意義；C1766T、T1768A和G1898A變異在HCC患者中的發(fā)生率也高于ACLF患者組,有統(tǒng)

18、計(jì)學(xué)意義,但發(fā)生率不高；G1862T和G1899A變異在兩組間的分布無(wú)顯著性差異。
　　 7)HBV前C/C基因啟動(dòng)子區(qū)不同位點(diǎn)變異在B和C兩種基因型間的發(fā)生率不同,G1896A和A1846T變異在B基因型毒株中的發(fā)生率顯著高于C基因型毒株(分別為:54.5％vs10.9％,P<0.001；44.8％vs7.3％,P<0.001),而T1753V和A1762T/G1764A變異在C基因型毒株中的發(fā)生率則顯著高于B基因型毒株(分別

19、為:21.8％vs5.5％,P=0.001；60.0％vs40.0％,P=0.011)；G1862T變異僅見(jiàn)于B基因型毒株,而且發(fā)生率很低；G1898A變異在C基因型毒株中的發(fā)生率略高于B基因型,而C1766T、T1768A、G1899A位點(diǎn)的變異在兩種基因型間無(wú)顯著性差異。
　　 8)在B基因型感染者中,ACLF患者中A1762T/G1764A、A1846T和G1896A變異的發(fā)生率均顯著高于CHB患者組(分別為:51.4％v

20、s29.3％,P=0.007；58.6％vs32.0％,P=0.001；68.6％vs41.3％,P=0.001),其余位點(diǎn)包括T1753V、C1766T、T1768A、G1862T、G1898A和G1899A發(fā)生率均非常低,其發(fā)生率在兩組病例間也無(wú)顯著性差異。另外A1762T/G1764A和G1896A聯(lián)合突變的發(fā)生率以及A1846T和G1896A聯(lián)合突變的發(fā)生率ACLF患者組均顯著高于對(duì)照的CHB組(分別為:31.4％vs10.7％

21、,P=0.002；47.1％vs21.3％,P=0.001)。
　　 9)在B基因型毒株感染者中,與ACLF相比,4個(gè)異變發(fā)生率較高的主要變異位點(diǎn)A1762T/G1764A、A1846T和G1896A以及A1762T/G1764A/G1896A三聯(lián)變異在HCC患者中的發(fā)生率均略高于ACLF患者組,但均無(wú)顯著性差異；T1768A在HCC中的發(fā)生率顯著高于ACLF組,但發(fā)生率不高,而G1899A的發(fā)生率HCC患者組顯著性高于ACLF

22、組(35.6％vs11.4％,P=0.002)。
　　 10)在CHB患者中,有A1762T/G1764A或G1896A變異組總膽紅素水平均高于A1762T/G1764A和G1896A變異雙陰性組(P<0.05)；有A1762T/G1764A和/或G1896A變異組HBV DNA水平均低于A1762T/G1764A和G1896A變異雙陰性組(P<0.001)。
　　 11)在309例CHB、ACLF和HCC感染者中HBe

23、Ag陰性感染者198例,HBeAg陽(yáng)性感染者111例,將HBeAg陰性感染者分為4種BCP/PC變異模式,即BCP-/PC-、BCP+/PC-、BCP-/PC+、BCP+/PC+(BCP:A1762T/G1764A;PC:G1896;+代表變異陽(yáng)性；-代表變異陰性),HBeAg陰性率在BCP-/PC-模式中最低(33.3％),其次為BCP+/PC-(67.8％),再次為BCP-/PC+(71.2％),在BCP+/PC+變異模式中的陰性率

24、最高(83.1％)。
　　 12)多因素分析發(fā)現(xiàn),HBV基因型B(OR=4.924[1.814—13.369],P=0.002)、A1762T/G1764A雙變異(OR=2.164[1.059-4.425],P=0.034)以及G1896A變異(OR=2.198[1.015-4.763],P=0.046)與ACLF的發(fā)生密切相關(guān),而HBeAg陰性感染以及A1846T變異與ACLF的發(fā)生相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 13)與

25、ACLF死亡相關(guān)多因素分析發(fā)現(xiàn),TBIL水平越高(高于425μmol/L,OR=7.298[1.298-41.023],P=0.024)以及凝血酶原活動(dòng)度(PTA)越低(低于27,OR=9.265[2.311-37.141],P=0.002),ACLF患者發(fā)生死亡的危險(xiǎn)性越高。
　　 結(jié)論:
　　 1)本研究通過(guò)對(duì)CHB、ACLF和HCC三組病例的對(duì)比,HBV基因型B在ACLF患者中流行高,基因型C在HCC患者中流行高,

26、提示基因型B與ACLF的發(fā)生相關(guān),而基因型C與HCC的發(fā)生相關(guān)。
　　 2)HBV前C/C基因啟動(dòng)子區(qū)不同位點(diǎn)的變異存在基因型間的差異,C基因型容易發(fā)生T1753V和A1762T/G1764A變異,而B(niǎo)基因型容易發(fā)生G1896A和A1846T變異,因此比較前C/C基因啟動(dòng)子區(qū)變異與疾病進(jìn)展的關(guān)系應(yīng)按照基因型的不同分組比較。
　　 3)G1896A和A1762T/G1764A變異是ACLF發(fā)生的危險(xiǎn)因素,A1846T變異與