未經(jīng)拉米夫定治療的乙型肝炎病毒YMDD變異基因芯片檢測(cè)及分析.pdf

1、目的：乙型肝炎病毒(HBV)是一種嗜肝DNA病毒，主要引起急、慢性肝炎、肝硬化和肝癌等。HBV的逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正閱讀功能，故HBV的變異率較其他DNA病毒高十倍以上，其基因變異對(duì)慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者病情發(fā)展、嚴(yán)重程度以及對(duì)抗病毒治療療效都有一定的影響。拉米夫定(lamivudine)是第一種用于治療乙肝的核苷類(lèi)藥物，但長(zhǎng)期用藥后易導(dǎo)致HBV的變異，從而出現(xiàn)病毒耐藥。HBV變異位點(diǎn)主要存在于HBV聚合酶C結(jié)構(gòu)域的YMDD(酪氨酸-蛋

2、氨酸-天門(mén)冬氨酸-天門(mén)冬氨酸)基因序列，最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)是M204氨基酸置換，產(chǎn)生YMDD變異(rtM204IV/I)，即YMDD變?yōu)閅VDD或YIDD。為探討YMDD變異株是在藥物作用下所致，還是變異株本來(lái)就與野生株共存，逐漸取代野生株成為優(yōu)勢(shì)毒株，本研究采用基因芯片技術(shù)對(duì)57例未經(jīng)抗病毒治療的慢性乙肝病毒感染者進(jìn)行YMDD及其變異株的檢測(cè)，分析未經(jīng)拉米夫定治療的HBV病毒YMDD變異出現(xiàn)的情況，探討HBV病毒YMDD變異出現(xiàn)可能的機(jī)

3、理，了解以YMDD自然變異的慢性HBV感染患者血清病毒載量和肝損害情況，以及與病毒基因型的關(guān)系。 方法： 1. 收集住院或門(mén)診HBV DNA陽(yáng)性，未經(jīng)拉米夫定治療的慢性HBV感染者血清標(biāo)本57例，且均已做了基因型檢測(cè)，其中B基因型50例，C基因型6例，B+C混合型1例；然后按臨床表現(xiàn)和其他檢查資料分為無(wú)癥狀攜帶者23例(其中B基因型19例，C基因型3例，B+C混合型1例)，輕、中度慢性乙肝26例(均為B基因型)，重型肝

4、炎、肝硬化6例(其中B基因型4例，C基因型2例)，肝癌2例(其中B基因型1例，C基因型1例)。 2．用基因芯片技術(shù)對(duì)上述57份血清進(jìn)行YMDD及其變異株的檢測(cè)，分析未經(jīng)拉米夫定治療的HBV病毒YMDD變異出現(xiàn)的情況，了解以YMDD自然變異的慢性HBV感染患者血清病毒載量和肝損害情況，以及與病毒基因型的關(guān)系。首先將血清標(biāo)本經(jīng)PCR擴(kuò)增出YMDD序列，引物用生物素(Biotin)進(jìn)行標(biāo)記，并分別取各擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，電泳后條帶

5、顯示均為陽(yáng)性。將擴(kuò)增產(chǎn)物變性，與基因芯片上特異性探針雜交、顯色后，判定HBV野生株(YMDD)、突變株(YVDD、YIDD)及其共生狀態(tài)和相對(duì)優(yōu)勢(shì)株。 3．對(duì)YMDD自然變異患者的上述臨床資料使用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，了解變異與臨床表現(xiàn)的關(guān)系，采用t檢驗(yàn)及X2檢驗(yàn)，以P>0.05為無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05為差異有顯著性。 結(jié)果：57例未經(jīng)拉米夫定治療的慢性HBV感染者中，有29例檢測(cè)出YMDD變異，陽(yáng)

6、性率50.89％，且均為野生株與突變株的混合感染，其中23例(40.35％)為YMDD與YVDD混合株，6例(10.53％)為YMDD與YVDD、YIDD混合株。其中39例男性患者中有22例被檢測(cè)出有YMDD變異，18例女性患者中有7例發(fā)生了YMDD自然變異，兩者變異陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=1.513，p=0.219>0.05)。YMDD野生株和變異株的HBV-DNA水平分別為106.464±1.427拷貝/毫升和107.069±

7、1.280拷貝/毫升(t=1.686，p=0.098，p>0.05)，HBeAg陽(yáng)性率分別為19/28(67.86％)和23/29(79.31％)(X2=0.964，p=0.326>0.05)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。YMDD野生株和變異株的ALT水平分別為221.04±467.38u/L和226.09±322.54u/L(t=0.048，p=0.962，p>0.05)，AST水平分別為224.69±495.48 u/L和150.25±18

8、1.55u/L(t=0.758，p=0.451>0.05)，ALB(白蛋白)水平分別為40.80±5.02g/L和42.38±6.38g/L(t=1.037，p=0.304>0.05)，TBIL水平分別為29.70±63.31 umol/L和37.78±68.57umol/L(t=0.462，p=0.646>0.05)，二者間的肝功能損害無(wú)顯著性差異。YMDD自然變異發(fā)生率在無(wú)癥狀攜帶者、輕中度慢性乙肝、重型肝炎及肝硬化和肝癌等不同臨床

9、類(lèi)型慢性肝病中無(wú)顯著性差異(X2=3.309，p=0.346>0.05)。本實(shí)驗(yàn)所收集病例的基因型比較單一，大部分均為B基因型(87.72％)，且所檢測(cè)的突變株均為YVDD陽(yáng)性，故可能提示B基因型更容易發(fā)生YVDD變異。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)采用基因芯片法對(duì)57例未經(jīng)拉米夫定治療的慢性HBV感染者進(jìn)行YMDD及其變異株的檢測(cè)，該方法操作簡(jiǎn)單，具有多位點(diǎn)的平行檢測(cè)特點(diǎn)，可同時(shí)檢測(cè)野生株和變異株的類(lèi)型。YMDD變異株與野生株一樣自然存在。