鴨乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥株的構(gòu)建及體內(nèi)感染.pdf

1、研究背景:
　　 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染呈世界性分布,全球約20億人曾感染過HBV,其中4億或5％的世界人口為慢性HBV感染者,每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化或原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)[1]。核苷(酸)類似物能有效抑制HBV復(fù)制,減少肝臟的炎癥活動,延緩或阻止肝臟疾病的進(jìn)展,減少肝癌的發(fā)生率。長期治療導(dǎo)致耐藥是目前核苷(酸)類似物抗HBV治療所面臨的主要難題。

2、　　 HBV耐藥突變的產(chǎn)生是逆轉(zhuǎn)錄過程中隨機發(fā)生的結(jié)果,在藥物選擇壓力下,具有復(fù)制優(yōu)勢的突變株在肝臟內(nèi)大量復(fù)制成為優(yōu)勢株。關(guān)于HBV復(fù)制周期的研究表明,共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是復(fù)制模板,可長期、穩(wěn)定地存在于肝細(xì)胞核內(nèi),是慢性HBV感染無法徹底清除的根本原因。在cccDNA層面研究耐藥病毒的出現(xiàn)、耐藥毒株在肝細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)變化規(guī)律等,能更好的解釋HBV耐藥的臨床病毒

3、學(xué)特點,為耐藥的預(yù)防和拯救治療等提供理論基礎(chǔ)。
　　 HBV感染具有高度種屬特異性,目前缺乏有效、適宜的動物模型。與HBV同屬嗜肝DNA病毒科的鴨乙型肝炎病毒(Duck hepatitis B virus,DHBV),在基因序列、致病機理及感染宿主規(guī)律等方面與HBV均有相似之處。關(guān)于DHBV的研究使人們認(rèn)識了嗜肝病毒的復(fù)制周期、病毒持續(xù)存在和難以徹底清除的機制。雛鴨接種DHBV感染易形成慢性感染、DHBV拉米夫定耐藥模式Y(jié)MDD

4、變異與HBV類似、鴨肝體積較大可得到充裕的肝組織等,這些特點有助于我們研究拉米夫定耐藥株的體內(nèi)感染狀態(tài),進(jìn)而探討HBV突變株的生物學(xué)特性和耐藥機理,對指導(dǎo)臨床調(diào)整和優(yōu)化抗病毒治療方案有重要意義。
　　 研究目的:
　　 1、構(gòu)建1.2倍基因組DHBV野生型及YMDD突變株的重組質(zhì)粒,為建立廣東櫻桃谷鴨拉米夫定耐藥DHBV動物模型奠定基礎(chǔ)。
　　 2、體外轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒至雞肝癌細(xì)胞系(LMH),研究突變株的復(fù)制活性及

5、拉米夫定耐藥性,并獲得來源單一、基因序列清楚的毒種,用于體內(nèi)感染。
　　 3、觀察和比較DHBV野生株與拉米夫定耐藥毒株接種雛鴨后形成慢性感染的特點,比較兩者的體內(nèi)復(fù)制活性。
　　 4、慢性DHBV感染動物應(yīng)用拉米夫定抑制病毒復(fù)制,探討半肝切除后肝細(xì)胞的快速再生能否為耐藥毒株提供傳播空間。
　　 研究方法:
　　 1、1.2倍鴨乙型肝炎病毒全基因重組質(zhì)粒及其突變株的構(gòu)建
　　 以廣東櫻桃谷鴨DHB

6、V分離株為模板,兩片段法PCR擴(kuò)增DHBV質(zhì)粒pcDNA3.1-DHBV2.0,獲得片段NX(2232nt-3021/lnt-1229nt)和XA(1208-284lnt),分別插入pMD19-T載體,構(gòu)建亞克隆:再分別經(jīng)NotⅠ、XhoⅠ和XhoⅠ、ApaⅠ酶切后依次插入pBluescriptⅡ KS(+)的相應(yīng)酶切位點,構(gòu)建總長為3631bp片段的重組質(zhì)粒PBS-DHBV1.2。利用QuikChange(R)XL Site—Dire

7、ctedMutagenesis Kit對YMDD區(qū)段進(jìn)行定點突變,獲得突變株P(guān)BS—DHBV1.2-M512V(YVDD)。
　　 2、構(gòu)建重組質(zhì)粒的序列鑒定
　　 分別采用引物對DNotⅠ/DXhoⅠR、DXhoⅠF/DApaⅠ和DSF1/DSR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增,初步鑒定重組質(zhì)粒成功。用限制性內(nèi)切酶NotⅠ、XhoⅠ和EcoRⅠ、ApaⅠ和XhoⅠ、ApaⅠ雙酶切以及EcoRⅠ單酶切對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。分別取三株野

8、生株和突變株陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行插入片段DNA的序列測定,確認(rèn)重組質(zhì)粒的成功構(gòu)建。
　　 3、瞬時轉(zhuǎn)染及體外藥物培養(yǎng)
　　 將LMH細(xì)胞接種至10cm細(xì)胞平皿(1.5×105),轉(zhuǎn)染前5 h換新鮮無抗生素的Waymouth培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合度80-85％時,分別將PBS-DHBV11.2或PBS-DHBV1.2-M512V質(zhì)粒和報告基因pSEAP按總DNA與FuGENETM6轉(zhuǎn)染試劑1:3的比例共轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞,設(shè)未轉(zhuǎn)染對照

9、和空載體對照；轉(zhuǎn)染后24小時、48小時、72小時換內(nèi)含不同濃度(0ng/ml、2ng/ml、20ng/ml、40ng/ml)3TC的培養(yǎng)液,藥物培養(yǎng)3天后收集LMH細(xì)胞。
　　 4、突變株重組質(zhì)粒的體外復(fù)制活性與拉米夫定抗性
　　 羅氏SEAP試劑盒檢測細(xì)胞上清中分泌性堿性磷酸酶(SEAP)的表達(dá)以平衡各組轉(zhuǎn)染效率；抽提DHBV的復(fù)制中間體,Southern印跡雜交檢測DHBVDNA復(fù)制中間體；采用KODAK Image

10、 Station2000成像系統(tǒng)分析Southern印跡雜交條帶的灰度值,SEAP平衡轉(zhuǎn)染效率后計算兩種質(zhì)粒的復(fù)制能力、繪制直線回歸方程、求出復(fù)制抑制率為50％時的拉米夫定濃度(IC50)。同時獲得細(xì)胞培養(yǎng)上清液,濃縮后作為體內(nèi)感染實驗毒種。
　　 5、DHBV野生株與拉米夫定耐藥毒株慢性感染的建立
　　 5.1實驗分組
　　 PCR法篩選出未感染DHBV的廣東櫻桃谷2日齡雛鴨17只,隨機分為3組:野生株組(8只

11、)、突變毒株組(7只)與生理鹽水對照組(2只)。腹腔接種收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清,連續(xù)觀察70天。接種后定期經(jīng)腿脛靜脈采血,最后肝活檢獲取鴨肝組織。
　　 5.2各項指標(biāo)檢測
　　 提取血清DNA,采用Taqman探針熒光定量PCR法檢測外周血病毒水平的動態(tài)變化；提取肝組織內(nèi)DHBV復(fù)制中間體和cccDNA,行Southern印跡雜交檢測；部分肝組織固定于10％甲醛溶液,常規(guī)HE染色與嗜銀染色觀察鴨肝臟的病理變化。
　　

12、 5.3統(tǒng)計學(xué)分析
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件,連續(xù)性變量符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩組整體血清病毒水平比較采用析因設(shè)計資料的方差分析(Bonferronic法);各時間點的組問病毒水平比較采用兩獨立樣本t檢驗；兩組DHBV慢性感染率比較采用Fisher確切概率法。所有統(tǒng)計采用雙側(cè)檢驗,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 6、半肝切除再生模型中DHBV突變株的動態(tài)變化
　　 6

13、.1實驗分組
　　 5只慢性DHBV感染動物其中4只(編號為V2、V3、V4、V7)持續(xù)服用拉米夫定(25mg/kg/day),每2周PCR檢測血清DHBV DNA至連續(xù)兩次陰性時行肝右葉半肝切除術(shù),于肝切后48小時、72小時靜脈接種突變株轉(zhuǎn)染上清,并繼續(xù)觀察4周；未治療鴨1只(編號為V1),僅行半肝切除與接種突變株轉(zhuǎn)染上清。
　　 6.2外周血中DHBV DNA水平及克隆病毒株的檢測
　　 抽提血清DNA,采用

14、實時定量PCR檢測DHBV DNA的動態(tài)變化。PCR擴(kuò)增血清DHBV,產(chǎn)物凝膠回收后連接T載體,篩選15個陽性克隆測序。
　　 6.3肝組織PCNA表達(dá)的檢測
　　 常規(guī)制備福爾馬林固定的石蠟包埋組織切片,免疫組織化學(xué)染色法檢測在肝臟中的表達(dá)。隨機觀察3個高倍視野,以肝細(xì)胞核呈界限清楚的棕色反應(yīng)為陽性,使用Image-Pro-Plus-6.0圖像軟件分析每個視野中陽性細(xì)胞數(shù)比例。
　　 6.4單個肝細(xì)胞核的分選及

15、核內(nèi)DHBV DINA的擴(kuò)增
　　 勻漿研磨10mg肝組織,勻漿液充分洗滌并濾網(wǎng)膜過濾。PCNA標(biāo)記細(xì)胞核,流式細(xì)胞儀分選出單個肝細(xì)胞核,并獲得PCNA陽性肝細(xì)胞核的百分比。分選的單個肝細(xì)胞核經(jīng)蛋白酶K、EcoRI酶消化后,巢式PCR擴(kuò)增DHBV的YMDD區(qū)段。
　　 6.5統(tǒng)計學(xué)分析
　　 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件分析。配對,檢驗比較拉米夫定治療動物給藥前后病毒水平；文獻(xiàn)報道拉米夫定治療可以降低總的病毒載量

16、,并未減少病毒感染的肝細(xì)胞數(shù)及增加肝細(xì)胞的再生。5只動物排除藥物的影響,半肝切除前后PCNA的表達(dá)方差不齊,使用F檢驗Welch法,進(jìn)一步多重比較采用Dunnett T3法；所有統(tǒng)計采用雙側(cè)檢驗,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、構(gòu)建重組質(zhì)粒的序列鑒定
　　 構(gòu)建PBS-DHBV1.2質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增、酶切和核苷酸全序列測定結(jié)果均與預(yù)期相符；PBS-DHBV1.2-M512V質(zhì)粒的YMD

17、D基序氨基酸突變?yōu)閅VDD。
　　 2、鴨乙型肝炎病毒YMDD突變株的表型耐藥
　　 Southern印跡雜交結(jié)果顯示野生株與突變株重組質(zhì)粒均能在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中檢出大量DHBV復(fù)制中間體,SEAP的表達(dá)平衡轉(zhuǎn)染效率后,野生株的復(fù)制能力是突變株的2.7倍,拉米夫定對野生株的體外復(fù)制活性具有抑制效應(yīng),藥物抑制野生株的IC50=10.90±4.80ng/ml,低于突變株的IC50=37.12±8.81ng/ml。
　　 3

18、、DHBV野生株與拉米夫定耐藥毒株慢性感染的建立
　　 3.1血清病毒水平的動態(tài)變化
　　 接種后,野生株組的病毒水平高于突變株組(7.40±2.68 vs5.82±1.10,F=29.633,P<0.01),比較各時間點兩組血清病毒量(野生株組對突變株組)在10天(7.97±1.91 vs6.23±0.29,t=2.543,P=0.037)、21天(8.66±1.50 vs5.68±0.39,t=5.411,p=0.0

19、01)、28天(8.11±2.58 vs5.77±1.21,t=2.191,P=0.047)、56天(7.57±2.57 vs4.24±1.14,t=2.686,P=0.023)、70天(7.70±2.87 vs4.13±1.05,t=3.024,P=0.016)5個觀測點差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,即野生株組鴨外周血中病毒血癥水平顯著高于突變毒株組。野生株組的慢性感染率為75％高于突變毒株組43％,但因樣本量較少,P=0.364兩組差異無統(tǒng)計

20、學(xué)意義。
　　 3.2肝內(nèi)病毒復(fù)制中間體與肝組織病理學(xué)改變
　　 實驗組鴨肝組織中均出現(xiàn)大量的DHBV DNA復(fù)制中間體,并且可以檢測到DHBV cccDNA的存在,說明該時期肝內(nèi)均有高水平的病毒復(fù)制。光鏡下HE染色鴨肝組織顯示實驗組有輕微的炎癥反應(yīng)；嗜銀染色均可見極少量匯管區(qū)芒狀纖維。
　　 4、半肝切除再生模型中DHBV突變株的動態(tài)變化
　　 4.1外周血中DHBV DNA水平與克隆病毒株的檢測

21、>　　 治療動物持續(xù)口服拉米夫定,使病毒滴度由基線的Log值7.62±2.56抑制到半肝切0天時的4.72±0.88,但因樣本量較少,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.439,P=0.093)。篩選血清中病毒株克隆結(jié)果顯示:未治療動物V1各時間點與治療動物半肝切除前均為野生株；接種突變株轉(zhuǎn)染上清后,V2在肝切10、17、31天時可檢測到4/15(26.7％)、1/15(6.7％)、1/15(6.7％)的突變株；V3在肝切10天時突變株比例為7

22、/15(46.7％)；V4在肝切17、31天時均為1/15(6.7％)；V7僅在肝切17天時檢測到1/15(6.7％)的突變株。
　　 4.2肝組織PCNA表達(dá)的檢測
　　 免疫組化檢測PCNA的表達(dá)顯示術(shù)前鴨肝組織中僅有極少量PCNA陽性染色肝細(xì)胞,術(shù)后PCNA肝細(xì)胞數(shù)量增多,部分細(xì)胞可見呈深棕褐色強表達(dá)。整體比較各時間點PCNA的表達(dá)指數(shù)具有顯著性差異(F=169.727,P<0.001),多重比較顯示半肝切10天、

23、17天、31天時PCNA標(biāo)記指數(shù)高于術(shù)前水平(0天VS10天.P=0.032,0天 VS17天.P=0.002,0天 VS31天 P<0.001)；流式標(biāo)記法的檢測結(jié)果與免疫組化一致,整體比較PCNA表達(dá)陽性肝細(xì)胞核比例有顯著性差異(F=22.921,P=0.004),多重比較半肝切10天、17天、31天時PCNA的標(biāo)記指數(shù)均高于術(shù)前(0天VS17天P=0.042,0天VS31天 P=0.029)。
　　 4.3肝細(xì)胞核內(nèi)突變株

24、比例的動態(tài)變化
　　 PCR擴(kuò)增肝細(xì)胞核內(nèi)DHBV結(jié)果顯示:V1、V7各時間點單個肝細(xì)胞核中的DHBV均為野生株,未檢測到突變株；V2在肝切10、17、31天時分別檢測到4(4.4％)、3(3.3％)、2(2.2％)個突變株rtM512V,V3在肝切10天時發(fā)現(xiàn)90個病毒陽性肝細(xì)胞核中有5個為突變株,V4在肝切17、31天時突變株比例均為1(1.1％)。其中突變株在給藥動物主要在術(shù)后10天、17天PCNA陽性細(xì)胞核內(nèi)檢測到。

25、r>　　 4.4半肝切除后PCNA標(biāo)記陰、陽性肝細(xì)胞核的病毒陽性率
　　 流式分選出無PCNA標(biāo)記、PCNA標(biāo)記陽性與PCNA標(biāo)記陰性的3類單個肝細(xì)胞核。巢氏PCR擴(kuò)增每類30個肝細(xì)胞核內(nèi)病毒,PCR產(chǎn)物約360bp左右。結(jié)果發(fā)現(xiàn):半肝切除后,PCNA陽性肝細(xì)胞核病毒陽性率呈下降趨勢,各時間點比例分別為47％±15％、52％±12％、42%±13％低于術(shù)前水平73％±19％；而PCNA陰性肝細(xì)胞核的病毒陽性率未見明顯波動,且P

26、CNA陽性肝細(xì)胞核的病毒陽性率低于PCNA陰性肝細(xì)胞核。
　　 結(jié)論:
　　 1、經(jīng)體外重組,成功構(gòu)建了含1.2倍DHBV全基因組片段的重組質(zhì)粒及其rtM512V突變株。
　　 2、建立了DHBV野生株和rtM512V突變株克隆的DHBV復(fù)制細(xì)胞模型,并證實突變株體外復(fù)制活性減弱,對拉米夫定敏感性下降；收集含有可復(fù)制病毒顆粒的細(xì)胞上清作為接種毒種,為下一步建立標(biāo)準(zhǔn)化的體內(nèi)感染模型提供基礎(chǔ)。
　　 3、DH