三氧化二砷抗鴨乙型肝炎病毒的體內(nèi)實驗.pdf

1、目的：創(chuàng)建鴨乙型肝炎病毒(DHBV)~ccDNATaqMan熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)檢測方法，建立福州麻鴨后天感染乙型肝炎動物模型，觀察三氧化二砷(As203)在體內(nèi)對DHBVDNA和DHBVcccDNA的抑制作用，并對其作用機制進行初步探討。 方法：用PUCm—T載體和DHBVcccDNAPCR純化產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)染TOPl0菌，篩選陽性菌落，提取質(zhì)粒，制作標準品；在DHBV基因組負鏈缺口兩側(cè)設(shè)計一對引物，并在引物間設(shè)

2、計和熒光標記一段TaqMan探針，嚴格優(yōu)化反應(yīng)物的組成和擴增條件，建立TaqMan熒光定量PCR檢測方法。篩選1日齡DHBVDNA(．)雛鴨，經(jīng)靜脈途徑接種DHBVDNA強陽性血清，建立福州麻鴨后天感染乙型肝炎動物模型：隨機分組，實驗組、拉米夫定對照組和空白對照組分別用As2O3、拉米夫定和0．9％氯化鈉溶液處理4w，停藥后觀察1w。用TaqMan熒光定量PCR法檢測治療前后血清中DHBVDNA和用藥后肝組織內(nèi)DHBVDNA和DHBVc

3、∞D(zhuǎn)NA含量，并檢測血清ALT、AST水平及肝組織HE染色病理。 結(jié)果：建立的DHBVcccDNATaqMan熒光定量PCR法靈敏度為l03copies／ml；在105一l09copies／ml之間，含量與Ct值具有很好的線性，Ct=一2．8361ln(x)+41．45，r：一0．9985；批內(nèi)誤差為O．2％～3．14％，批間誤差為2．22％～4．43％。動物模型用藥4w后，As2O3治療組的病毒抑制率顯著高于空白對照組(分別是

4、9．19％和．5．12％，P<0．05)，抗病毒效果與用藥劑量和用藥時間相關(guān)。停藥1w后，As2O3治療組血清DHBVDNA含量無反跳現(xiàn)象，肝組織DHBVDNA含量顯著低于空白對照組，肝組織內(nèi)DHBVcccDNA含量跟空白對照組比較無顯著性差異。治療4w和停藥1w后血清ALT、AST及肝臟病理檢查結(jié)果，As203治療組與空白對照組無顯著性差異。 結(jié)論：TaqMan熒光定量PCR檢測方法是一種靈敏度高、特異性強的DNA定量檢測技術(shù)