利用基因捕獲技術(shù)建立穩(wěn)定的HBV感染細(xì)胞模型.pdf

1、目的和意義：將乙型肝炎病毒DNA整合到細(xì)胞基因組中，建立在體外穩(wěn)定表達(dá)HBV的細(xì)胞模型。為進(jìn)一步研究相關(guān)基因?qū)BV復(fù)制的調(diào)節(jié)作用奠定基礎(chǔ)。方法：pGEM．I-IBVl 3質(zhì)粒經(jīng)HindlII限制性?xún)?nèi)切酶消化，將I-IBVl3全長(zhǎng)DNA切下，與同樣經(jīng)HindlII限制性?xún)?nèi)切酶降解過(guò)的PU2l連接，得到PU21一HBV重組質(zhì)粒。將該重組質(zhì)粒采用電擊轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入HepG2細(xì)胞中，G418篩選陽(yáng)性克隆并以X-gal染色、PCR、RT-PCR、

2、Southem blot、ELISA等方法驗(yàn)證HBV DNA的插入和表達(dá)。結(jié)果：PU21．HBV重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序證明HBVl3全長(zhǎng)DNA正確與PU21載體連接，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后經(jīng)G418篩選，得到一系列陽(yáng)性克隆，Southern blot證實(shí)HepG2細(xì)胞基因組中含I-IBVDNA，RT-PCR結(jié)果表明HBV DNA在HepG2細(xì)胞中有功能基因的轉(zhuǎn)錄。結(jié)論：HBVl 3已被整合在HepG2細(xì)胞染色體中并能穩(wěn)定表達(dá)其RNA。穩(wěn)