利用基因編輯技術(shù)TALEN建立K562細胞系FLT3-ITD敲入模型.pdf

1、第一部分基因編輯技術(shù)TALEN的構(gòu)建及其突變篩選體系的優(yōu)化和比較
　　類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)是人工構(gòu)建的序列特異性核酸內(nèi)切酶的一種,它能夠識別并切割特定的DNA靶序列,造成雙鏈斷裂,并引起基因組結(jié)構(gòu)的定點改變。它2010年底成功應(yīng)用于基因打靶,很快成為一種比鋅指核酸酶(Zinc-fingernuclease,ZFN)更容易設(shè)計

2、、特異性更高和毒性更低的人工核酸內(nèi)切酶。本文將用舉例的方法從TALEN的設(shè)計、構(gòu)建及六種活性或突變效率檢測方法來建立并完善TALEN平臺,并從方法的難易程度及優(yōu)缺點進行評估六種突變率檢測方法和合適的應(yīng)用范圍。通過UA(UnitAssembly,單元組裝)和GoldenGateVectorbasedAssembly方法合成TALEN質(zhì)粒,并比較酶切,SSA檢測系統(tǒng),T7E1酶切加毛細血管電泳檢測,加藥T在檢測以及單克隆檢測等方法,比較構(gòu)建

3、及篩選的優(yōu)缺點。我們成功構(gòu)建了TANLEN質(zhì)粒,并建立了較多的檢測TALEN切割效果的方法,比較了各種方法的優(yōu)缺點,找到合適的評估體系。我們推薦T7E1酶切試驗作為早期篩選,選擇最佳的TALEN質(zhì)粒;切割雙熒光報告系統(tǒng)可以作為后期單克隆篩選的重要的富集系統(tǒng)。
　　第二部分利用TALEN基因編輯技術(shù)建立K562細胞系FLT3/ITD敲入模型
　　FLT3/ITD突變是預(yù)測AML復(fù)發(fā)最重要的危險因素,能引起受體酪氨酸激酶顯著而持

4、久的活化,促進細胞增殖并抵抗凋亡。然而酪氨酸激酶抑制劑通常只能取得有限的血液學(xué)緩解,不能延長患者生存。因此,篩選FLT3/ITD突變促進白血病轉(zhuǎn)化、加速疾病進展的關(guān)鍵基因或通路具有重要的理論和現(xiàn)實意義。然而FLT3/ITD突變常附加于其他具有表達譜特征的重現(xiàn)性遺傳學(xué)異常,會對ITD突變相關(guān)基因或通路的篩選帶來影響。在本次實驗組,我們利用TALEN技術(shù)在白血病細胞株K562中的FLT3基因區(qū)引入或修正ITD突變,并分別從基因水平、表達水平

5、、細胞行為學(xué)包括細胞增殖、凋亡、周期、等幾個方面,以及下游基因的變化證實,該模型不僅在基因水平上有ITD的插入,同時也表達正確形式的FLT3/ITD剪切體,并具備相應(yīng)的功能,引起了細胞行為學(xué)的相關(guān)變化。因此,我們成功建立了K562細胞系FLT3/ITD敲入模型。該模型有助于篩選出FLT3/ITD突變促進白血病轉(zhuǎn)化、加速疾病進展的關(guān)鍵基因或信號通路,為解析FLT3-ITD突變的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子機制,探尋潛在的治療靶點提供參考。
　　第

6、三部分利用TALEN技術(shù)建立K562細胞系中半敲除FLT3基因模型及其相關(guān)效應(yīng)研究
　　正常的FLT3在維持造血系統(tǒng)的正常功能有重要的作用和意義。各種惡性血液病均有有不同程度的表達FLT3。大量的AML的樣本觀察到FLT3基因轉(zhuǎn)錄水平的增加,而這增加表達也可能有助于FLT3的磷酸化及其通路的激活。惡性血液病中,FLT3表達量高的患者具有更糟的OS和更低的無事件生存率。因此,了解FLT3在惡性血液病中的作用是非常重要。本文利用TAL

7、EN技術(shù)在K562上建立FLT3半敲除模型,通過比較半敲模型機野生型的K562細胞的細胞行為學(xué)變化以及效應(yīng)相關(guān)基因的變化,結(jié)果顯示,半敲除FLT3基因是細胞增殖減弱,克隆形成能力下降,同時隨著FLT3基因的下降,其下游相關(guān)基因BASP1,IGFBP2,MSI2,STON2,PROX1也隨之下降,說明些基因與FLT3有明顯的相關(guān)性。由此說明抑制FLT3可以抑制腫瘤細胞的增殖生長及克隆形成,同時抑制FLT3,也抑制BASP1,IGFBP2,