利用TALEN技術(shù)構(gòu)建UrotensinⅡ基因敲除小鼠模型.pdf

1、【背景與目的】：尾加壓素II（Urotensin II，UII）是迄今為止哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)，主要分布于心血管和神經(jīng)組織；G蛋白偶聯(lián)受體GPR14是其特異性受體，也主要分布于心血管和神經(jīng)系統(tǒng)，UII可通過(guò)與 GPR14結(jié)合引起細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度增加，參與許多生物學(xué)效應(yīng)，如收縮血管、收縮氣道、促進(jìn)細(xì)胞增殖、促進(jìn)基質(zhì)表達(dá)及細(xì)胞遷移等。在心血管系統(tǒng)中，參與血壓調(diào)節(jié)、心肌缺血、心肌收縮、心肌重構(gòu)及血管平滑肌細(xì)胞增殖等，在冠心病

2、、高血壓、糖尿病心肌病等發(fā)病過(guò)程中起著重要作用。在既往UII相關(guān)研究中，學(xué)者們利用外源性藥物干預(yù)、UII轉(zhuǎn)基因構(gòu)建動(dòng)物模型等干預(yù)方式進(jìn)行了一系列研究，而隨著UII相關(guān)研究的深入，利用基因敲除技術(shù)構(gòu)建UII基因敲除模型則是不可避免的、重要的研究手段，將有利于深入探討UII的生理和病理生理意義，有助于探討心血管疾病發(fā)生的新機(jī)制和治療的新方法。
　　類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcriprtion activator-like

3、effctor nuclease，TALEN）介導(dǎo)的基因靶向修飾技術(shù)是目前應(yīng)用較廣泛的成熟的基因敲除技術(shù)，它主要包含有兩個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域：特異性識(shí)別核酸的靶點(diǎn)識(shí)別區(qū)域和切斷 DNA序列的核酸酶功能結(jié)構(gòu)域。本研究利用TALEN技術(shù)人工構(gòu)建針對(duì)外顯子的重組核酸酶TALEN，在體內(nèi)對(duì)特定位點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，利用細(xì)胞自身DNA損傷后的非同源末端鏈接（non-homologous end joining, NHEJ）引入基因突變、敲除以達(dá)到目的

4、基因UII失活的效果，從而實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)修飾的目的，并建立C57BL/6J小鼠UII基因敲除的動(dòng)物模型。
　　【方法】：采用生物信息學(xué)方法，分析C57BL/6J小鼠UII基因的編碼序列，在線設(shè)計(jì)UII敲除位點(diǎn)并針對(duì)外顯子設(shè)計(jì)靶點(diǎn)。利用模塊組裝法克隆，構(gòu)建特異性 TALE靶點(diǎn)結(jié)合域，進(jìn)行組裝TALEN模塊，得到左右臂完整的TALEN質(zhì)粒，經(jīng)菌液PCR及雙酶切驗(yàn)證質(zhì)粒活性。提取TALEN質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染Hepa細(xì)胞，經(jīng)提取DNA、PCR電泳、

5、酶切鑒定TALEN打靶質(zhì)粒剪切活性。酶切TALEN打靶載體使其線性化，體外轉(zhuǎn)錄成mRNAs。利用顯微注射的方式注入到C57BL/6J小鼠受精卵中，并移植到受體雌鼠。取出生2周齡小鼠尾巴對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定、構(gòu)建TA克隆測(cè)序確認(rèn)突變體的基因型，篩選出UII基因敲除的C57BL/6J小鼠。將F0代陽(yáng)性小鼠繁殖得到純合UII基因敲除小鼠后代。
　　【結(jié)果】：在UII基因的外顯子上設(shè)計(jì)了TALEN識(shí)別剪切位點(diǎn)，經(jīng)菌液PCR、雙酶切