兩種基因定點(diǎn)敲除技術(shù)TALEN和CRISPR在擬南芥中的應(yīng)用.pdf

1、近年來(lái)，隨著多種特異性核酸酶的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，基因組編輯技術(shù)的高效性和準(zhǔn)確性顯著提高。該類技術(shù)的廣泛應(yīng)用使得基因功能的研究、遺傳性疾病的治療以及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展等各個(gè)領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展。
　　TALEN(transcription activator like effectors nuclease)和CRISPR(clusteredregμlatory interspersed short palindromic repeat)是

2、兩種目前最有效的基因定點(diǎn)敲除新技術(shù)。這兩種體系中都含有人工重組的核酸內(nèi)切酶，可以對(duì)DNA進(jìn)行靶向切割，造成DNA雙鏈斷裂(DSB)，進(jìn)而引發(fā)非同源末端連接(NHEJ)或同源重組(HR）等DSB修復(fù)途徑。NHEJ修復(fù)過(guò)程中極易發(fā)生堿基的缺失、插入和置換，TALEN和CRISPR就是利用這一特性，實(shí)現(xiàn)基因的靶向敲除。
　　三個(gè)擬南芥基因IAA2、SIRT2和SAUR41的功能和作用機(jī)理是本實(shí)驗(yàn)室的重要研究?jī)?nèi)容，為了獲得功能完全喪失的突

3、變體，以深化先前的研究，我們?cè)O(shè)計(jì)和構(gòu)建了針對(duì)這三個(gè)基因的TALEN和CRISPR定點(diǎn)敲除體系。另一方面，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥花序直接轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，TALEN和CRISPR的應(yīng)用還不夠成熟，本文也嘗試在方法學(xué)上作一些探討。
　　首先，我們獲得了三個(gè)基因兩種敲除技術(shù)共六大組合的轉(zhuǎn)基因擬南芥T1代株系。接著，我們利用T7核酸內(nèi)切酶識(shí)別并切割DNA錯(cuò)配的原理，在T1代株系的葉片細(xì)胞中檢測(cè)體細(xì)胞突變。另外，我們還從T1代株系誘導(dǎo)愈傷組織，在

4、愈傷組織細(xì)胞中檢測(cè)體細(xì)胞突變。最后，我們?cè)赥2代株系和愈傷組織再生植株中篩查種系突變。
　　結(jié)果表明:(1)TALEN體系中，IAA2基因的體細(xì)胞突變率最高，愈傷組織細(xì)胞中可達(dá)31.6％; CRISPR體系中，SAUR41基因的體細(xì)胞突變率最高，葉片細(xì)胞中可達(dá)16.1％;(2)TALEN和CRISPR相比，前者造成的DNA缺失片段更長(zhǎng)，可能參與的DSB修復(fù)機(jī)制更復(fù)雜;(3)葉片細(xì)胞和愈傷組織細(xì)胞相比，后者的基因突變率高2倍左右，利