玉米兩種硫氧還蛋白的重組表達、純化和定點突變.pdf

1、硫氧還蛋白（Thioredoxin，Trx）廣泛存在各種生物體中，具有二硫鍵異構(gòu)酶活性，是細胞氧化還原信號的主要傳遞者，在蛋白質(zhì)翻譯后修飾起重要作用。高等植物含有Trx種類最為豐富，分別存在細胞質(zhì)、線粒體和葉綠體中，其中，葉綠體含有f型、m型、x型和y型Trx。已報道，利用f型和m型Trx活性中心保守的Cys殘基突變體，篩選出C3植物中90多種和Trx突變體結(jié)合的葉綠體靶蛋白。擬南芥和菠菜葉綠體f型和m型Trx的性質(zhì)已有研究，它們的分子

2、量約12 kD，蛋白活性中心含有保守的WCGPC序列，兩個半胱氨酸殘基可通過巰基和二硫鍵的轉(zhuǎn)換催化靶蛋白二硫鍵和巰基的轉(zhuǎn)換。目前，玉米葉綠體Trx性質(zhì)尚不清楚。本研究克隆了編碼玉米Trx-f和Trx-m成熟蛋白的基因，并定點突變了這兩種Trx活性中心的編碼保守Cys殘基，在大腸桿菌中重組表達和純化了野生型和突變體Trx，結(jié)果如下：
　　 1．根據(jù)已公布的玉米編碼Trx的氨基酸序列，利用Clustal W軟件進行氨基酸序列比對，分

3、別選取氨基酸序列同源性較高的Trx-f和Trx-m，利用ChloroP軟件分析編碼Trx的導(dǎo)肽序列，Trx-f編碼的第一個氨基酸殘基為Ser54，Trx-m編碼的第一個氨基酸殘基為Ser58，利用NEBcutter軟件預(yù)測編碼成熟蛋白基因的限制性酶切位點，設(shè)計PCR擴增引物。提取玉米B73自交系幼葉總RNA，經(jīng)一步法RT-PCR擴增Trx-f和Trx-m編碼基因，擴增產(chǎn)物分別約400 bp和300 bp，測序，利用BLAST軟件序列比對

4、表明與登陸的玉米Trx序列一致。
　　 2．將克隆的基因插入表達載體pQE80，表達的重組蛋白N端多了MRGSH6G氨基酸殘基，根據(jù)Translate tool軟件確定基因和編碼的氨基酸序列，設(shè)計突變引物，將Trx-m活性中心WCGPC的的第二個Cys殘基突變成Ala殘基，Trx-f活性中心第二個Cys突變成Ser殘基，測序證明定點突變結(jié)果。
　　 3．將兩種Trx插入表達載體pSUMO，表達的重組蛋白在N端上游含有SU

5、MO標簽，Ni-NTA純化，SDS-PAGE檢測到分子量約30 kD特異條帶，利用純化的SUMO專一蛋白水解酶Ulp除去SUMO標簽，獲得在N端儀多一個Gly殘基的兩種Trx蛋白。插入pQE80表達的野生型和突變型Trx，Trx-f、 Trx-m表達的突變體和野生型蛋白分子量分別約為18 kD和14 kD。
　　 綜上所述，本研究克隆玉米編碼f型和m型Trx成熟蛋白的基因，定點突變了兩種Trx活性中心第二個保守的Cys殘基，表達