兩種新腫瘤相關(guān)抗原的純化與分析.pdf

1、目的：惡性腫瘤是影響人類身心健康的重大問題，世界衛(wèi)生組織發(fā)表的一項(xiàng)研究報(bào)告表明，全球癌癥狀況將同益嚴(yán)重，今后20年新發(fā)病人數(shù)將由目前的每年1000萬增加到1500萬，癌癥死亡人數(shù)也將由每年600萬增至1000萬。 癌癥的發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜，機(jī)體在各種致癌因素(物理、化學(xué)、生理)的作用下，形成癌腫，其本質(zhì)是一種基因病，也是一種分子病。正常細(xì)胞的癌變與多種基因的作用有關(guān)，根據(jù)這些基因在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的生物學(xué)行為，可分為腫瘤基因、腫瘤

2、抑制基因、腫瘤轉(zhuǎn)移基因和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因4大類。在這4類基因中，前后兩對(duì)基因各自又形成一對(duì)既相互對(duì)立，又互相制約的兩對(duì)性質(zhì)各異，且具有正負(fù)調(diào)控作用的兩大基因系統(tǒng)，從而維持著機(jī)體細(xì)胞的精細(xì)平衡。腫瘤相關(guān)基因在結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生的異常，將導(dǎo)致腫瘤表達(dá)一些在質(zhì)和量上異常的蛋白或多肽，也就是腫瘤抗原。腫瘤抗原分為腫瘤相關(guān)性抗原和腫瘤特異性抗原。近幾年來，隨著腫瘤抗原鑒定技術(shù)的發(fā)展，極大的促進(jìn)了人們對(duì)腫瘤的認(rèn)識(shí)和診斷治療的發(fā)展。 SC抗原(

3、SCAg)是用人新鮮結(jié)腸癌實(shí)體瘤細(xì)胞免疫BALB/c小鼠制備的16種單克隆抗體所識(shí)別的一組腫瘤相關(guān)抗原。在胰腺、大腸、小腸、胃和乳腺等上皮性腫瘤組織中呈高表達(dá)，而在正常組織和胚胎組織中無表達(dá)或低表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)使用免疫沉淀的方法純化培養(yǎng)細(xì)胞的裂解物，獲得了高純度的腫瘤抗原SCAg3A，SCAg6。與用腫瘤組織裂解純化抗原比較，可以免受組織成分的干擾，尤其是白蛋白。有了高純度的腫瘤抗原以后就可以對(duì)抗原的氨基酸序列進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)一步可以對(duì)腫瘤抗原

4、基因進(jìn)行分子克隆，從而獲得大量的腫瘤抗原蛋白。對(duì)其性質(zhì)和功能的深入研究，可以理解腫瘤抗原在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用以及探討腫瘤的免疫逃避機(jī)制等等。 早期診斷是腫瘤治療的關(guān)鍵，可以提高腫瘤的治愈率、降低死亡率。如果使用本實(shí)驗(yàn)的腫瘤抗原與傳統(tǒng)的腫瘤抗原作為靶抗原進(jìn)行聯(lián)合診斷，可以提高相關(guān)腫瘤的診斷率。目前，以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗在腫瘤預(yù)防和治療領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)，使腫瘤疫苗成為當(dāng)前生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。本文中的抗原純化后可以直接制備成腫瘤

5、疫苗或著將腫瘤抗原體外致敏樹突狀細(xì)胞(DC)作為疫苗，也可將編碼腫瘤抗原的基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，可以有效地提高瘤苗的免疫原性。用腫瘤抗原基因修飾DC等抗原遞呈細(xì)胞更是一種值得重視的瘤苗設(shè)計(jì)方案。方法：腹水單克隆抗體SCAb3A和SCAb6由本研究所制備。腫瘤細(xì)胞系由本所保存及北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈(zèng)，免疫沉淀試劑盒為美國(guó)Pierce公司產(chǎn)品。 復(fù)蘇液氮中凍存的腫瘤細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)和傳代。用辛酸法純化腹水單克隆抗體并與免疫沉淀柱進(jìn)行耦聯(lián)

6、。對(duì)所培養(yǎng)的大腸癌細(xì)胞系 LS-180,Cola205,SW1116．肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和乳腺癌細(xì)胞系SK用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法進(jìn)行鑒定，選取陽性細(xì)胞系LS-180。刮取離心收集陽性細(xì)胞并用PBS離心洗滌3次，裂解液4℃裂解30min后又使用冰浴超聲裂解10min，經(jīng)透析后制備成粗提抗原，然后通過免疫沉淀進(jìn)行分離、純化。濃縮后以SDS-PAGE、Western blot和點(diǎn)雜交(Dot blot)對(duì)純化抗原進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：免疫

7、細(xì)胞化學(xué)染色顯示，SCAg3A及SCAg6蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞系LS-180中表達(dá)，主要位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中，在乳腺癌細(xì)胞系SK中呈低表達(dá)，在其它細(xì)胞系中無表達(dá)。經(jīng)純化后的SCAg3A和SCAg6，通過SDS-PAGE均顯示一條帶，其分子量分別約為60.1 kD和59.0 kD。Western blot與其相應(yīng)抗SCAg單克隆抗體反應(yīng)良好，點(diǎn)雜交檢測(cè)結(jié)果與Western blot一致，并且發(fā)現(xiàn)SCAg3A和SCAg6之間無交叉反應(yīng)。