稻飛虱兩種sdRNA傳導(dǎo)相關(guān)基因克隆與功能研究.pdf

1、RNAi是指由內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失。
　　 灰飛虱Laodelphax striatellus(Fallen)和褐飛虱Nilaparvata lugens(stal)同屬于半翅目(Hemiptera)蟬亞目(Cicadomorpha)蠟蟬總科(Fulgoroidea)中的飛虱科(Delphac

2、idae)，都是全球性糧食作物的重要害蟲，不僅能刺吸為害而且還能傳播病毒。對稻飛虱的防治主要以化學(xué)農(nóng)藥防治為主，不但造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染，破壞生態(tài)平衡，使農(nóng)藥殘留增大，對人和其它動物健康構(gòu)成威脅。因此，需要更清潔安全的防治技術(shù)替代傳統(tǒng)技術(shù)。近幾年，越來越多的學(xué)者將RNAi技術(shù)應(yīng)用于稻飛虱，試圖開發(fā)新的防治途徑。
　　 dsRNA的傳導(dǎo)是引發(fā)RNAi的關(guān)鍵一環(huán)，本研究基于國內(nèi)外對dsRNA傳導(dǎo)的研究，以兩種稻飛虱的sid和chc同

3、源基因?yàn)檠芯繉ο?，在活體昆蟲中驗(yàn)證兩種基因與dsRNA傳導(dǎo)的關(guān)系，以便尋找切實(shí)可行的提高RNAi效應(yīng)的途徑，為在昆蟲研究領(lǐng)域更好的應(yīng)用RNAi技術(shù)提供依據(jù)。
　　 現(xiàn)將主要研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　 1、灰飛虱sid-1-like基因和網(wǎng)格蛋白重鏈基因全長克隆
　　 本研究首先利用灰飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選網(wǎng)格蛋白重鏈（Clathrin heavy chain，Chc）和sid-1-like的基因，獲得相關(guān)基因片段后進(jìn)行

4、克隆驗(yàn)證，并設(shè)計特異性引物，采用RACE技術(shù)進(jìn)行基因全長克隆，利用序列分析軟件對全長序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，克隆chc基因得到的序列長度為5，347bp，ORF編碼961個氨基酸，編碼的蛋白分子量為110.1078kD，PI為5.36，且具有clathrin7-fold repeat特征區(qū)域，聚類分析顯示與不同生物Chc基因同源，與其它昆蟲Chc聚為一大類，相似度達(dá)92％以上?？寺id-1-like基因獲得的序列全長為2，515bp

5、bp，ORF編碼648個氨基酸，所編碼的蛋白分子量為52.0588kD，PI為8.98，通過氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析可知克隆的基因與線蟲和棉蚜sid-1同源基因的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)具有極高的相似性，并都具有11個跨膜區(qū)域等sid-1-like基因的特征，聚類分析顯示與不同生物sid-1-like基因同源，相似度在22％至81％之間，其中與近緣種褐飛虱的sid-1-like基因相似性最高，達(dá)到81％。由此認(rèn)為所克隆的序列全長分別是灰飛虱的Chc同源基因和

6、sid-1-like基因，被分別命名為Lschc和Lssid。該研究為設(shè)計dsRNA，利用RNAi深入研究其功能，以及在灰飛虱RNAi中的作用，奠定了基礎(chǔ)。
　　 2、沉默灰飛虱sid-1-like基因和灰飛虱網(wǎng)格蛋白重鏈基因?qū)绎w虱RNAi的影響
　　 本研究以灰飛虱幾丁質(zhì)合成酶基因（Lschi）為報告基因，通過兩次RNAi手段，測定干擾灰飛虱chc和sid-1-like基因是否影響dschi對灰飛虱網(wǎng)格蛋白重鏈基因的

7、干擾作用。結(jié)果表明，單獨(dú)喂食dssid及dschc對灰飛虱的死亡率（5.25％和3.98％）和chi基因的相對表達(dá)水平（1.33和1.19）沒有顯著影響，與喂食dsEGFP的對照處理(5.07％;1.0)沒有顯著差異。表明單獨(dú)干擾sid和chc不會影響灰飛虱chi基因的表達(dá)，也不會影響試蟲的死亡率變化。但單獨(dú)喂食dschi可以顯著抑制灰飛虱chi基因的表達(dá)，其表達(dá)水平僅有對照的40％，同時導(dǎo)致試蟲死亡率顯著升高(22.78％)，是dsG

8、FP處理的4.6倍。將dschi與dssid或/和dschc混合喂食處理時，dschi對chi基因表達(dá)的抑制作用以及對試蟲的致死效應(yīng)，均大幅下降。喂食dssid+dschi、dschc+dschi及dssid+dschc+dschi混合dsRNA的chi基因相對表達(dá)量沒有顯著差異，分別為0.77、0.64和0.81，但顯著高于dschi單獨(dú)處理而低于對照處理。檢測試蟲的死亡率也得到類似結(jié)果，即3種混合處理之間沒有顯著差異，4d累積死亡率

9、分別為，6.65％、6.61％和7.43％，但顯著低于dschi處理(22.78％)高于dsGFP處理(5.07％)。此外，試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)調(diào)整dssid+dschc+dschi的混合比例對干擾效果沒有顯著影響。顯然干擾sid和chc均會顯著影響灰飛虱體內(nèi)的RNAi，且兩者表現(xiàn)的抑制效應(yīng)相當(dāng)。由此表明sid和chc均是灰飛虱體內(nèi)RNAi的重要功能基因。
　　 3、沉默褐飛虱sid-1-like和褐飛虱網(wǎng)格蛋白重鏈基因?qū)诛w虱RNAi的

10、影響
　　 本研究以褐飛虱幾丁質(zhì)合成酶（Nlchi）為報告基因，通過兩次RNAi手段，測定了干擾褐飛虱chc和sid基因是否影響dschi對Nlchi基因的干擾作用。結(jié)果表明，單獨(dú)喂食dssid(8.05％)，和單獨(dú)喂食dschc(15.30％)的死亡率，均顯著高于單獨(dú)喂食dsEGFP的死亡率(2.84％)，而兩處理對Nlchi基因的表達(dá)水平（1.09和1.26）沒有顯著影響，與喂食dsEGFP的(1.21)沒有顯著差異。表明單

11、獨(dú)干擾褐飛虱sid-1-like和褐飛虱網(wǎng)格蛋白重鏈不會影響Nlchi基因的表達(dá)，但對試蟲的有一定的致死效應(yīng)。單獨(dú)喂食dschi可以顯著抑制Nlchi基因的表達(dá)，其表達(dá)水平(0.33)僅有對照的33％，同時導(dǎo)致試蟲死亡率顯著升高(28.29％)，是dsEGFP處理的14倍。將dschi與dssid或/和dschc混合喂食處理時，dschi對Nlchi基因表達(dá)的抑制作用以及對試蟲的致死效應(yīng)，均大幅下降。喂食dssid+dschi、dsch

12、c+dschi及dssid+dschc+dschi混合dsRNA4d累積死亡率分別為，16.07％、19.63％和19.65％，處理間無顯著差異，但顯著低于dschi處理(28.29％)高于dsEGFP處理(2.84％)。檢測三處理的Nlchi基因相對表達(dá)量沒有顯著差異，分別為1.06、0.77和1.14，但顯著高于dschi單獨(dú)處理(0.33)而低于對照處理。證實(shí)干擾Nlsid和Nlchc均會顯著影響褐飛虱體內(nèi)的RNAi，且干擾Nls