稀杯盔形珊瑚兩種抗氧化相關(guān)蛋白(Ferritin,CuZnSOD)的基因克隆及原核表達.pdf

1、廣東海洋大學碩士學位論文稀杯盔形珊瑚兩種抗氧化相關(guān)蛋白(FerritinCuZnSOD)的基因克隆及原核表達范程輝指導(dǎo)教師：劉麗教授申請學位類別：理學專業(yè)名稱：海洋生物學研究方向：海洋經(jīng)濟動物發(fā)育生物學學院名稱：水產(chǎn)學院中國湛江2014年6月分類號：Q781密級：公開UDC：606學號：2111101101I稀杯盔形珊瑚兩種抗氧化相關(guān)蛋白(FerritinCuZnSOD)的基因克隆及原核表達摘要近年來由珊瑚白化現(xiàn)象導(dǎo)致的珊瑚生態(tài)系統(tǒng)失衡

2、問題越來越嚴重，為了探究珊瑚本身對環(huán)境氧化脅迫的響應(yīng)機制，本研究克隆得到了稀杯盔形珊瑚兩種抗氧化相關(guān)蛋白（鐵蛋白和銅鋅超氧化物歧化酶）的基因cDNA全序列，對編碼的目的蛋白進行生物信息學分析，并在體外原核表達成功。主要研究結(jié)果如下：1.鐵蛋白基因研究結(jié)果（1）鐵蛋白基因cDNA全序列的克隆及序列分析利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reversetranionpolymerasechainreactionRTPCR)和cDNA末端快速擴增法(r

3、apidamplificationofcDNAendsRACE)克隆獲得了稀杯盔形珊瑚鐵蛋白(Ferritin)的基因cDNA全序列，其長度為906bp，5非編譯區(qū)(5UTR)為130bp，3非編譯區(qū)(3UTR)為257bp，開放閱讀框(F)長度為519bp，編碼172個氨基酸。Ferritin基因的5UTR含有一個鐵反應(yīng)元件(IRE)CAGTGA，3UTR含有一個加尾信號序列ATTAAA，末端具有polyA尾巴。預(yù)測編碼的Ferrit

4、in氨基酸序列的分子量(Mw)為20.0kDa，理論等電點(pI)為5.00。該蛋白具有脊椎動物鐵蛋白H亞基保守的特征結(jié)構(gòu)域，即一個鐵氧化酶中心(Tyr26，Tyr29，Tyr31)和一個鐵核形成位點(Glu59，His62)，推測其同時具有H亞基和L亞基特性。預(yù)測氨基酸序列并未發(fā)現(xiàn)信號肽，也未預(yù)測到可能的跨膜結(jié)構(gòu)；位于細胞質(zhì)、線粒體和細胞核中的可能性分別為73.9%、8.7%和8.7%，而在其他細胞器中的可能性更小，證明Ferriti

5、n合成后定位在細胞質(zhì)。（2）鐵蛋白基因的原核表達Ferritin基因F與表達載體pET28a連接構(gòu)建得到原核表達載體，IPTG終濃度為1mM、37℃誘導(dǎo)4h，在BL21(DE3)大腸桿菌中得到大量表達。2.銅鋅超氧化物歧化酶基因研究結(jié)果（1）銅鋅超氧化物歧化酶基因的克隆及序列分析克隆獲得的稀杯盔形珊瑚的銅鋅超氧化物歧化酶(CuZnSOD)基因cDNA全序列為730bp，5UTR為111bp，3UTR為188bp，F(xiàn)為471bp，編碼15