兩種鞘翅目昆蟲(chóng)抗菌肽的分離純化與活性研究.pdf

1、抗菌肽是由基因編碼的一類小分子多肽，在昆蟲(chóng)先天性免疫系統(tǒng)中占有重要地位，通常由10-50個(gè)氨基酸組成，多數(shù)為堿性、陽(yáng)離子肽，帶2-7個(gè)正電荷，具有水溶性好、熱穩(wěn)定性高、活性廣泛、細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，極有可能成為新一代抗生素的替代藥物，因而成為生命科學(xué)、藥學(xué)和免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。昆蟲(chóng)是自然界種類最多、數(shù)量最大的生物類群，同時(shí)也是抗菌肽未被充分挖掘的寶庫(kù)。從豐富的昆蟲(chóng)資源中分離、提取和鑒定具有生物活性的抗菌肽或先導(dǎo)化合物是昆蟲(chóng)抗菌肽

2、藥物研究和開(kāi)發(fā)的重要步驟。
　　本論文以鞘翅目昆蟲(chóng)黃粉蟲(chóng)（Tenebrio molitor Linnaeus）幼蟲(chóng)、喙尾琵甲（Blaps rhynchoptera Fairmaire）幼蟲(chóng)為研究材料，通過(guò)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)和大腸桿菌(Escherichia coli)混合液針刺誘導(dǎo)使其產(chǎn)生抗菌肽，采用不同溶液對(duì)其體內(nèi)的抗菌肽進(jìn)行提取，經(jīng)多次凝膠色譜、反相色譜、高效液相色譜，成功地從黃粉蟲(chóng)幼

3、蟲(chóng)、喙尾琵甲幼蟲(chóng)粗提物中獲得了具有明顯抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的小分子肽類，主要研究結(jié)果如下：
　　（1）抗菌肽最佳提取溶液的篩選：通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較了10％乙酸溶液、0.1%三氟乙酸溶液、Tris-HCl（pH8.0）、Tris-HCl（pH6.5）等4種不同的溶液對(duì)黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)抗菌肽的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10%乙酸粗提物和10%乙酸空白對(duì)照都有抑菌作用，導(dǎo)致對(duì)抑菌活性的歸屬產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，因而不宜做提取溶液；其余3種提取液只有0.1%三氟乙酸提取

4、物經(jīng)后續(xù)凝膠柱預(yù)純化后，能夠檢測(cè)到明顯的抑菌活性，所以確定0.1%三氟乙酸作為2種昆蟲(chóng)抗菌肽的最佳提取溶液。
　?。?）抗菌肽的預(yù)純化及 Tricine-SDS-PAGE：黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)0.1%三氟乙酸粗提物經(jīng)SephadexG50凝膠層析后，非誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)組均得到2個(gè)峰，其中第二個(gè)峰TFADZP2、TFAYDP2對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用，對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌無(wú)活性；喙尾琵甲幼蟲(chóng)0.1%三氟乙酸粗提物經(jīng)Sup

5、erose12凝膠柱預(yù)純化后，非誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)組均得到3個(gè)峰，其中第一個(gè)峰HWDZP1、HWYDP1對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出抑制作用，對(duì)大腸桿菌無(wú)活性，此外誘導(dǎo)組HWYDP1還對(duì)綠膿桿菌表現(xiàn)出抑制作用；Tricine-SDS-PAGE結(jié)果表明，黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)抗菌肽TFADZP2、TFAYDP2主要由分子量40 kD以下的小肽組成，喙尾琵甲抗菌肽HWDZP1、HWYDP1主要由分子量20 kD以下的小肽組成。
　?。?）抗菌肽

6、誘導(dǎo)組與非誘導(dǎo)組活性的比較：2種昆蟲(chóng)誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組粗提物經(jīng)純化后都能檢測(cè)到抑菌活性，而且誘導(dǎo)組在較低濃度時(shí)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌圈直徑明顯大于非誘導(dǎo)組，抑菌活性較強(qiáng)，表明實(shí)驗(yàn)得到的2種昆蟲(chóng)抗菌肽在體內(nèi)都有基礎(chǔ)表達(dá)，經(jīng)菌液誘導(dǎo)后活性有所增強(qiáng)。對(duì)喙尾琵甲來(lái)說(shuō)，誘導(dǎo)組還增加了對(duì)綠膿桿菌的抑制活性，說(shuō)明誘導(dǎo)可能導(dǎo)致抑菌譜擴(kuò)大。
　　（4）黃粉蟲(chóng)抗菌肽的純化及鑒定：經(jīng)兩步Superdex Peptide凝膠色譜、一步反相色譜和一步高效液相色

7、譜，從黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)誘導(dǎo)組純化出一個(gè)具革蘭氏陽(yáng)性菌抑制活性的組分，命名為T(mén)FAYDP2-2-1-1-2，液相色譜檢測(cè)純度為單一組分，質(zhì)譜顯示其分子量為2552.5Da，屬于小分子抗菌肽，該組分對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑制濃度分別為10μg/mL和20μg/mL，對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌、綠膿桿菌無(wú)活性。目前鞘翅目昆蟲(chóng)還未見(jiàn)如此低分子量的抗菌肽報(bào)道。
　?。?）喙尾琵甲抗菌肽的純化：喙尾琵甲幼蟲(chóng)誘導(dǎo)組預(yù)純化組分經(jīng)一步反相色譜純

8、化，得到組分HWYDP1-1，對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用。
　　綜上所述，采用0.1%三氟乙酸作為黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)抗菌肽的提取溶液，通過(guò)兩步凝膠柱層析、一步反相色譜和一步高效液相色譜從黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)抗菌肽粗提物中獲得了一個(gè)純化組分，具有較強(qiáng)的抑制金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌活性，對(duì)這兩種革蘭氏陽(yáng)性菌的最小抑制濃度分別是10μg/mL和20μg/mL。但是該組分對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌、綠膿桿菌無(wú)活性；質(zhì)譜測(cè)定其分子量為2552.5Da