中國(guó)林蛙抗菌肽的分離純化及cDNA克隆.pdf

1、本研究通過(guò)反相高效液相法從中國(guó)林蛙皮膚分泌物中分離、純化得到3種多肽，經(jīng)抑菌試驗(yàn)分析表明，其中兩種多肽具有較強(qiáng)的抑菌活性。將其進(jìn)行Tris-TricineSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，測(cè)定其分子量為7.0kDa左右，經(jīng)PVDF轉(zhuǎn)膜后，利用Edaman降解法分別測(cè)定其N(xiāo)末端10個(gè)氨基酸序列。然后應(yīng)用在線(xiàn)程序CODEHOP(Consensus-degeneratehybridoligonucleotideprimers)設(shè)計(jì)

2、簡(jiǎn)并引物，同時(shí)提取蛙皮總RNA，采用RT-PCR及RACE法，首次克隆得到兩條中國(guó)林蛙抗菌肽基因cDNA序列，分別命名為CAMPs-1(GenBanK登錄號(hào)：DQ471289)和CAMPs-2(GenBanK登錄號(hào)：DQ471290)，CAMPs-1基因cDNA序列全長(zhǎng)為285bp，其中包括183bp完整的開(kāi)放閱讀框(openreadingframe，ORF)，推測(cè)編碼61個(gè)氨基酸的多肽(chensirin-1)，分子量(MW)為7.1

3、03kDa，同時(shí)含有102bp的3’非轉(zhuǎn)譯區(qū)(3'UTR)；CAMPs-2基因cDNA序列全長(zhǎng)為279bp，其中包括177bp完整的開(kāi)放閱讀框(openreadingframe，ORF)，推測(cè)編碼59個(gè)氨基酸的多肽(chensirin-2)，分子量(MW)為6.980kDa，同時(shí)含有102bp的3’非轉(zhuǎn)譯區(qū)(3'UTR)。生物信息學(xué)分析表明，CAMPs-1和CAMPs-2氨基酸序列(即chensirin-1,chensirin-2)N末

4、端均含有一個(gè)相對(duì)保守的由22個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列。通過(guò)chensirin-1和chensirin-2與已克隆的蛙屬抗菌肽序列的Blast比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，其與蛙屬抗菌肽的同源性較高，分別為63﹪～86﹪和57﹪～81﹪，說(shuō)明chensirin-1和chensirin-2為蛙屬抗菌肽家族的兩個(gè)新成Z員。 綜上所述，利用3’RACE技術(shù)首次從中國(guó)林蛙皮膚中分離到中國(guó)林蛙抗菌肽基因CAMPs-1、CAMPs-2，并對(duì)其基因