麥胚抗菌肽集與分離純化技術(shù)研究.pdf

1、本研究選用麥胚為原料，采用保溫孵育的方法，研究不同孵育條件及孵育液組分下麥胚肽含量和抗菌活性等的變化規(guī)律。通過培養(yǎng)條件和培養(yǎng)液組成優(yōu)化，得到有利于抗菌肽累積的孵育工藝和參數(shù)，分析了孵育過程中麥胚主要成分的變化，對(duì)孵育得到的抗菌肽進(jìn)行了分離純化，同時(shí)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了探討。研究結(jié)果如下：
　　 1、隨著麥胚孵育時(shí)間延長，其游離氨基酸和多肽含量逐漸增加，可溶性蛋白含量先降低后升高，淀粉含量先上升后下降，還原糖含量逐漸升高后趨于平緩，粗脂

2、肪含量逐漸降低。研磨處理可以促使麥胚中酶與底物充分接觸，反應(yīng)更完全，從而促進(jìn)肽富集。采用正交設(shè)計(jì)考察了時(shí)間、溫度和液料比三因素對(duì)麥胚孵育液中肽富集量和抗菌活性的影響。結(jié)果表明：麥胚孵育富集抗菌肽的最佳孵育條件是：時(shí)間1.0 h、溫度45℃和液料比為25:1。在此條件下富集的抗菌肽抑菌圈大小為16.00 mm，是未孵育麥胚的1.23倍。
　　 2、采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)考察了CaCl2、ZnSO4、MgSO4、Mn

3、SO4、Nacl、KCl、抗壞血酸(Vc)、半胱氨酸(L-cysteine)和谷胱甘肽(GSH)對(duì)麥胚孵育液抗菌活性的影響，用最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)呈顯著正效應(yīng)的添加物進(jìn)行最佳添加量優(yōu)化。結(jié)果表明：Vc、L-cysteine和GSH對(duì)抑菌圈大小呈現(xiàn)顯著正效應(yīng)；經(jīng)響應(yīng)面分析顯示，抑菌圈大小與培養(yǎng)液組分濃度間的二次多項(xiàng)模型顯著(P<0.05)，可用于預(yù)測和分析麥胚孵育液的抗菌活性。優(yōu)選出三種有利于麥胚孵育液的抗菌活性的添加物是Vc、L-

4、cysteine和GSH，最佳的添加濃度分別是6.11 mmol/L，26.87 mmol/L和6.78mmol/L。在此條件下孵育的麥胚，富集的抗菌肽抑菌圈直徑達(dá)到23.63 mm，是對(duì)照的1.60倍。
　　 3、麥胚孵育液經(jīng)80％乙醇處理，可除去大部分大分子的蛋白、糖等雜質(zhì)，經(jīng)超濾后得到四個(gè)組分，對(duì)這些組分進(jìn)行抗菌活性檢驗(yàn)，結(jié)果表明：分子量小于10 K的具有抗菌活性。分子量小于10 K的組分經(jīng)SephadexG-25分離，得

5、到三個(gè)主要組分G-25-1、G-25-2和G-25-3，抗菌活性檢驗(yàn)表明：抗菌活性物質(zhì)存在于G-25-2中；G-25-2經(jīng)SephadexG-10進(jìn)一步分離，得到G-10-1、G-10-2、G-10-3和G-10-4四個(gè)組分，分別進(jìn)行抗菌活性檢驗(yàn)：G-10-2具有抗菌活性。G-10-2經(jīng)半制備型HPLC制得五個(gè)組分HPLC-1、HPLC-2、HPLC-3、HPLC-4和HPLC-5，抗菌活性檢驗(yàn)表明：HPLC-2為所需抗菌肽。ESI-M

6、S質(zhì)譜分析和氨基酸組成分析表明，麥胚孵育液中HPLC-2抗菌肽分子量為456.84 Da，其氨基酸組成為Glu-Tyr-Phe。對(duì)此抗菌肽的抗菌作用進(jìn)行研究得到：HPLC-2抗菌肽對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌(枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌)和革蘭氏陰性細(xì)菌(大腸桿菌和綠膿桿菌)均有不同程度的抑制作用，對(duì)試驗(yàn)所用真菌無明顯抑制作用；HPLC-2抗菌肽對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)為500μg/ml；分離純化得到的HPLC-2抗菌肽在1