兩種生防活性蛋白Harpin-,Xooc-和AiiA的表達(dá)及生物活性檢測.pdf

1、農(nóng)藥伴隨人類改造自然、征服自然已有一百多年的歷史，在植物保護(hù)中發(fā)揮了巨大的作用，促進(jìn)了農(nóng)業(yè)發(fā)展，給人類帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。然而使用農(nóng)藥所引起的副作用，如：病蟲草產(chǎn)生抗藥性、對(duì)非靶標(biāo)生物的直接毒害、對(duì)環(huán)境的污染等，已成為了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上迫切需要解決的問題。二十世紀(jì)70年代基因工程技術(shù)的出現(xiàn)，為解決這些問題提供了新的途徑與思路。 Harpins是革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌通過Ⅲ型泌出系統(tǒng)分泌的一類能誘導(dǎo)非寄主植物過敏反應(yīng)和系統(tǒng)獲得抗性的非

2、特異性蛋白激發(fā)子。本研究采用PCR方法從水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv．oryzicola，Xooc)RS105菌株中擴(kuò)增harpin<,Xooc>編碼基因hrf2，將其克隆到酵母表達(dá)載體pPICZαA的分泌信號(hào)肽基因下游，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-hrf2。重組表達(dá)質(zhì)粒線性化后電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母(Pichia pastoris)宿主菌X-33，經(jīng)抗生素Zeocin篩選和PCR鑒定后，得到重組酵母菌

3、X-33/pPICZαA-hrf2。用甲醇誘導(dǎo)重組酵母菌表達(dá)目標(biāo)蛋白，發(fā)酵上清液經(jīng)濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，在約18 kD處有特異目標(biāo)條帶出現(xiàn)。Westem Blot檢測表明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性。生物活性檢測表明酵母重組表達(dá)蛋白harpin<,xooc>能夠誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生過敏反應(yīng)和促進(jìn)煙草生長，活性高于在大腸桿菌中表達(dá)的harpin<,Xooc>。 aiiA基因編碼的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHLs)水解酶(AiiA蛋

4、白)能降解細(xì)菌產(chǎn)生的AHLs信號(hào)分子，干擾該信號(hào)分子參與細(xì)菌群體感應(yīng)的調(diào)控過程，抑制多種植物病原菌致病基因的誘導(dǎo)表達(dá)，從而減輕或消除病原菌的致病性。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已報(bào)道的aiiA基因序列設(shè)計(jì)引物，從枯草芽胞桿菌中成功擴(kuò)增出一段長為753 bp的序列，測序后經(jīng)blast比對(duì)，結(jié)果表明與已發(fā)表的aiiA基因序列相似性均在85％以上。將此基因克隆到pET30(a)表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，超量表達(dá)的蛋白在菌體中以