兩種海南海洋生物抗炎活性物質(zhì)研究.pdf

1、海洋約占地球總表面積71％，是地球上最大的生命棲息地。由于海洋生態(tài)環(huán)境的特殊性（高鹽度、高壓、缺氧、避光）和生物鏈之間的密切相關(guān)性，海洋生物次生代謝產(chǎn)物與陸地植物提取的化合物具有顯著結(jié)構(gòu)差異，其中有些產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎獨(dú)特并具有良好的生物活性，是藥物研究與開發(fā)的基礎(chǔ)和寶庫(kù)。海洋生物軟珊瑚（Soft coral）和海綿（Marine sponge）一直是海洋天然產(chǎn)物的研究熱點(diǎn)。為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)海洋產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性及新穎性，尋找活性強(qiáng)、作用機(jī)制新穎的先

2、導(dǎo)化合物。
　　本實(shí)驗(yàn)選取了兩種海洋生物作為研究對(duì)象，進(jìn)行了研究與探索：（1）對(duì)采自中國(guó)南海三亞附近海域的軟珊瑚Sinularia flexibilis進(jìn)行了化學(xué)成分研究和抗炎活性初篩；（2）對(duì)從南海海綿Jaspis stellifera中分離得到的具有抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）活性的先導(dǎo)化合物Stellettin B進(jìn)行了抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制的探索。
　　本文以甲醇為提取溶劑，對(duì)

3、軟珊瑚樣品Sinularia flexibilis進(jìn)行多次提取，對(duì)甲醇提取濃縮物用水和二氯甲烷進(jìn)行萃取，得到水層和二氯甲烷層提取物，綜合運(yùn)用硅膠薄層色譜、柱色譜、半制備HPLC等多種分離手段，從軟珊瑚Sinularia flexibilis二氯甲烷層提取濃縮物中共分離得到12個(gè)化合物，結(jié)合核磁共振光譜（1D、2D NMR）、質(zhì)譜（ESI-MS）、紅外光譜（IR）和相關(guān)文獻(xiàn)鑒定出化合物的平面結(jié)構(gòu)及立體結(jié)構(gòu)，分別為：sinulaflexio

4、lide L(1)，isosinuflexibilin D(2)，thioflexibilolide A(3),(-)14-deoxycrassin(4),(1R,13S,12S,9S,8R,5S,4R)-9-acetoxy-5,8:12,13-diepoxycembr-15(17)-en-16,4-olide(5)，sinulariolide(6)，dihydrosinularin(7)，sinularin(8),11-dehydro

5、sinulariolide(9)，epoxycembrane A(10)，diepoxyceane A(11)，flexilarin B(12)；其中化合物1和2為未見文獻(xiàn)報(bào)道的新化合物。
　　本文利用RAW264.7巨噬細(xì)胞進(jìn)行了各單體化合物對(duì)一氧化氮（Nitric Oxide，NO）抑制作用的初步研究。在非細(xì)胞毒劑量下，以Griess法檢測(cè)各化合物對(duì)脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)

6、胞釋放NO抑制活性。結(jié)果表明，化合物5、6、7和9具有明確的NO生成抑制作用，IC50值分別為24.0μM、42.2μM、6.1μM和8.5μM。
　　本文采用類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的呈纖維樣滑膜細(xì)胞（Fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS）為Stellettin B抗RA作用機(jī)制模型，利用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（Thiazolyl Blue Tetrazolium Brom

7、ide，MTT）法評(píng)價(jià)化合物細(xì)胞毒性，以AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)其對(duì)FLS細(xì)胞凋亡的影響，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其對(duì) FLS細(xì)胞周期的影響，采用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assy，ELISA）檢測(cè)在LPS誘導(dǎo)下，化合物對(duì)體外培養(yǎng)的FLS細(xì)胞上清液中的白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α

8、）、IL-17、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(Matrix Metalloproteinase-3，MMP-3)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1，TIMP-1)分泌水平的影響，探索化合物抗RA作用機(jī)制，結(jié)果如下：
　　1. MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性：Stellettin B對(duì)FLS細(xì)胞顯示了很強(qiáng)的毒性作用，IC50值為5.86μM。
　　2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡及周期

9、：藥物濃度在1、5和10μM時(shí)，細(xì)胞的凋亡率與藥物濃度呈劑量依賴性；但當(dāng)藥物濃度達(dá)到50μM時(shí)，細(xì)胞的凋亡率不高，但壞死率大大增加。當(dāng)藥物濃度為1和5μM時(shí)，其對(duì)G2/M期有顯著地阻滯作用。
　　3. ELISA法檢測(cè)：在LPS誘導(dǎo)下，Stellettin B顯著地抑制IL-1β、TNF-α分泌，且抑制率呈劑量依賴性；對(duì)IL-17分泌有較弱的抑制作用；對(duì)MMP-3分泌有抑制作用，對(duì)TIMP-1分泌有促進(jìn)作用，MMP-3/TIMP-

10、1比值隨著濃度的降低呈增高趨勢(shì)。
　　上述抗NO產(chǎn)生的活性評(píng)價(jià)表明，軟珊瑚Sinularia flexibilis中含有抗炎有效成分，其中化合物5、6、7和9活性較好。細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期及細(xì)胞因子檢測(cè)的結(jié)果表明，從海綿中分離得到的stellettin B抗RA作用是通過(guò)抑制FLS細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)FLS細(xì)胞G2/M期阻滯而達(dá)到抑制滑膜增生的效果；通過(guò)抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的促炎因子如，IL-1β、TNF-α和IL