兩種蛇毒中抗補體活性成分的篩選及研究.pdf

1、目 的：對中華眼鏡蛇毒和烙鐵頭蛇毒進行抗補體活性篩選，以期從中發(fā)現(xiàn)新的抗補體蛋白，并對其分離純化、理化性質和抗補體活性加以研究，對其可能的應用前景加以評價。 研究方法：1.采用SP Sephadex C-25離子交換柱層析和RP-HPLC從中華眼鏡蛇（Naja atra）蛇毒中分離純化目標蛋白；采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和MALDI-TOF-MS對目標蛋白的表觀分子量、精確分子量和純度進行測定；等電聚焦電泳法

2、測定等電點；Edman降解法對其N端序列進行部分測定；測定目的蛋白對補體經(jīng)典途徑和替代途徑溶血的抑制活性；采用綿羊紅細胞、豚鼠紅細胞和兔紅細胞測定目標蛋白的溶血活性；采用MTT法測定對腫瘤細胞K562細胞株的抗腫瘤作用，SRB法測定對腫瘤細胞A549和MCF-7細胞株的抗腫瘤作用；采用KB平板擴散法測定抗菌活性；測定目的蛋白對經(jīng)典途徑C3轉化酶形成的影響，判斷其可能的作用機制。 2．采用Q Sepharose Fast Flow

3、陰離子交換柱層析、SP Sephadex C-25陽離子交換柱層析、Sephacryl S-200凝膠柱層析、1ml Hitrap SP HP、1ml Hitrap SP HP、1ml Hitrap Heparin HP和Superdex 75凝膠柱層析對國產(chǎn)烙鐵頭蛇（Trimeresurus mucrosquamatus）蛇毒中的抗補體成分進行分離，并同時測定各初分峰的纖維蛋白原水解活性及精氨酸酯酶等生物活性。 結

4、 果：1.從中華眼鏡蛇毒中分離出一個新的抗補體蛋白，精確分子量為7kD，等電點為9.81；N端序列結果表明與細胞毒素有較高的同源性；抗補體活性測定表明，它對正常人血清補體經(jīng)典途徑的激活抑制作用較明顯，而對替代途徑抑制作用較弱，同時對豚鼠和大鼠血清補體經(jīng)典途徑的激活抑制不明顯，機制研究表明，主要通過抑制經(jīng)典途徑中C3轉化酶形成達到抗補體作用。而溶血測定表明對綿羊紅細胞和兔紅細胞都沒有溶血作用，對豚鼠紅細胞有輕微的溶血作用；同時對K56

5、2、A549、MCF-7細胞株有抑制作用；對枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌的生長有抑制作用； 2．對烙鐵頭蛇毒中的抗補體活性成分進行了初步的分離。其中粗毒經(jīng)Q Sepharose Fast Flow離子交換層析后的分離峰中，峰1具有抗補體活性；峰1～6具有纖維蛋白原水解活性、精氨酸酯酶活性、水腫活性；峰1～4具有出血活性、峰1、3～6有抗凝活性。 結 論：1.兩種蛇毒中均存在抗補體活性成分。 2．從中華

6、眼鏡蛇毒中首次分離純化出一個分子量為7kD的新的抗補體蛋白，它對補體的抑制作用呈現(xiàn)一定的種屬依賴性，對正常人血清中補體經(jīng)典途徑的抑制作用較明顯，而對豚鼠和大鼠血清中補體經(jīng)典途徑的抑制不明顯。通過對其理化性質和生物學活性的研究，為進一步的深入研究提供了依據(jù)和參考，同時，對其開展結構與功能的研究也有助于抗補體肽類藥物的設計，具有潛在的應用價值。 3．通過對烙鐵頭蛇毒中抗補體活性成分的分離條件的摸索以及粗分峰多種生物活性的測定，為下一