Harpin-,Xooc-蛋白編碼基因在轉(zhuǎn)基因油菜后代中的遺傳表達(dá)以及對(duì)農(nóng)藝性狀的影響.pdf

1、Harpins是一類由革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的非寄主?；约ぐl(fā)子，可以激發(fā)煙草的過敏反應(yīng)（Hypersensitive Response，HR），誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性、抗蟲性并可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)。Hapins類激發(fā)子都具有相似的生化特征：富含甘氨酸（Gly），不含半胱氨酸（Cys），熱穩(wěn)定，對(duì)蛋白酶敏感。經(jīng)Harpin蛋白處理，植物可以對(duì)真菌、細(xì)菌、害蟲等多種病原物產(chǎn)生抗性。將編碼Harpin蛋白的基因轉(zhuǎn)入水稻、煙草、馬鈴薯等植物中，能

2、提高轉(zhuǎn)基因植株的抗病水平。
　　 hrf2基因來源于水稻細(xì)條斑病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzicola菌株RS105，該基因共414 bp，其產(chǎn)物HarpinXooc（HpaG）含138個(gè)氨基酸，分子量約為15.3KD。HarpinXooc蛋白具有與其他Harpins蛋白類似的特征和功能，能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性、抗蟲性并促進(jìn)植物生長(zhǎng)。本研究旨在將編碼HarpinXooc的基因hrf2轉(zhuǎn)化油菜，以期獲得抗

3、病性提高和性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因油菜，為新品系的培育奠定基礎(chǔ)。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含有hrf2基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301：：hrf2介導(dǎo)轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜揚(yáng)油4號(hào)，經(jīng)GUS染色和PCR檢測(cè)，共篩選了16株抗性再生植株（T0代）。自花授粉得到的種子在田間種植作為T1代，GUS組織化學(xué)染色分析結(jié)果表明：外源基因在后代中的分離情況符合孟德爾單基因3:1分離定律。對(duì)T1代GUS染色呈陽(yáng)性的植株進(jìn)行PCR檢測(cè)、Southe

4、rn blot檢測(cè)、RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果證明，hrf2基因已整合到油菜基因組中并能在轉(zhuǎn)錄水平正常表達(dá)。株系T1-1中，外源基因的拷貝數(shù)為1。為了鑒定轉(zhuǎn)基因植株的抗病性，對(duì)PCR陽(yáng)性植株進(jìn)行離體葉片抗菌核病實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：株系T1-1、T1-2、T1-3、T1-4、T1-5的病斑直徑顯著小于對(duì)照，最小的只有1.6 cm，與對(duì)照相比，減小32.4％。
　　 我們選擇T1代中PCR結(jié)果呈陽(yáng)性且抗病性提高的32棵植株自花授粉，收獲的種子

5、第二年在田間種植作為T2代。PCR結(jié)果表明，有78％的植株能擴(kuò)增出約414 bp的特異性條帶，經(jīng)測(cè)序，與hrf2基因一致性為100％。離體葉片抗病性結(jié)果表明：32個(gè)株系中，62.5％的轉(zhuǎn)基因株系病斑顯著小于對(duì)照，其中45％的株系在0.01的水平病斑顯著小于對(duì)照，抗病性顯著提高。
　　 田間條件下，轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)健康，發(fā)育正常，轉(zhuǎn)基因植株的部分農(nóng)藝性狀發(fā)生變異，但T1、T2代植株的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)穩(wěn)定。轉(zhuǎn)基因植株開花期延遲，與未轉(zhuǎn)化