轉(zhuǎn)Harpin-,Xooc-蛋白編碼基因?qū)τ筒宿r(nóng)藝性狀及抗菌核病的影響.pdf

1、由革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的Harpins可以激發(fā)煙草過(guò)敏性細(xì)胞壞死(hvpersensitive cell death，HCD)，誘導(dǎo)植物抗病、抗蟲(chóng)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。Harpins類(lèi)激發(fā)子都具有相似的生化特征：富含甘氨酸(Gly)，不含半胱氨酸(Cys)，熱穩(wěn)定，對(duì)蛋白酶敏感。溫室和田間實(shí)驗(yàn)表明，Harpins蛋白處理植物可以誘導(dǎo)對(duì)真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲(chóng)等多種病原物的抵抗，提高植物的產(chǎn)量。此外，將harpin轉(zhuǎn)化煙草，水稻，梨樹(shù)，都能

2、不同程度的提高轉(zhuǎn)基因植株的抗性。因此，本研究旨在將編碼harpin<,Xooc>的基因hrf2轉(zhuǎn)化油菜，以期提高油菜的抗病性和產(chǎn)量。 hrf2基因來(lái)源于水稻細(xì)條斑菌Xanthomonas oryzae pv．oryzicola 菌株RS105，該基因含414 bp，其推測(cè)的產(chǎn)物Hrf2含138個(gè)氨基酸，分子量約為15.3×10<'3>。hrf2基因編碼的harpin<,Xooc>蛋白具有與其他Harpins蛋白類(lèi)似的特征和功能。

3、hrf2表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)植物抗病性、抗蟲(chóng)性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等有益效應(yīng)。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR方法，從水稻細(xì)條斑菌Xanthomonas oryzae pv．oryzicola菌株RS105中擴(kuò)增出hrf2基因，將其克隆入植物表達(dá)載體pBI121，構(gòu)建pBIl21：：hrf2重組質(zhì)粒。然后將hrf2基因及其啟動(dòng)子和終止子用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ從pBIl21：：hrf2上切下后回收，連接到用這兩個(gè)酶切過(guò)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pCA

4、MBIA1301上，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)基因載體pCAMBIA1301：：hrf2。重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，經(jīng)酶切，測(cè)序驗(yàn)證后，通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌LBA4404。菌落PCR和酶切檢測(cè)后，挑選陽(yáng)性克隆供轉(zhuǎn)化油菜使用。 由根癌農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)，將重組表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA1301：：hrf2轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜楊油4號(hào)子葉節(jié)，獲得了抗潮霉素的再生轉(zhuǎn)基因油菜植株。經(jīng)PCR，Southem，RT-PCR和GUS染色檢測(cè)證明h

5、rf2基因已整合到油菜基因組中，并且能在轉(zhuǎn)錄水平正常表達(dá)。從轉(zhuǎn)hrf2基因的油菜中提取的可溶性蛋白注射煙草能引起過(guò)敏反應(yīng)。 在相同培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因油菜的株高、葉片大小與受體植株無(wú)明顯差異，生長(zhǎng)發(fā)育正常，無(wú)肉眼可見(jiàn)的HR。轉(zhuǎn)基因油菜的花期略有推遲，結(jié)實(shí)率差異較大；所有轉(zhuǎn)基因植株的每莢粒數(shù)均少于對(duì)照，但部分轉(zhuǎn)基因植株的千粒重與對(duì)照相比顯著增加。T1代油菜種子在含有hyg 50 mg/L的培養(yǎng)基上出現(xiàn)抗感分化?？共⌒澡b定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)