安全轉(zhuǎn)基因油菜的獲得及其抗菌核病研究.pdf

1、油菜是我國重要的油料作物,菌核病作為油菜生產(chǎn)中最主要的病害,嚴(yán)重影響著我國油菜的品質(zhì)和產(chǎn)量,因此,控制油菜菌核病已成為當(dāng)前油菜生產(chǎn)中亟待解決的問題。盡管轉(zhuǎn)基兇技術(shù)已在多種作物中取得了巨大的成功,但公眾對轉(zhuǎn)基因作物生物安全性問題的日益擔(dān)憂,明顯限制了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在油菜育種中的應(yīng)用。
　　 研究表明,來自益母草的抗真菌蛋白基因LJAMP2,經(jīng)離體試驗結(jié)果顯示對菌核病菌(Sclerotinasclerotiorum)具有很強(qiáng)的抗性。同時

2、,“Gene-deletor”刪除系統(tǒng)在煙草上的成功應(yīng)用,消除了轉(zhuǎn)基因植物中可能存在的生物安全性問題。故在本研究中,我們將益母草脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因LJAMP2搭建在“Gene-deietor”刪除系統(tǒng)內(nèi)并轉(zhuǎn)化油菜,獲得安全轉(zhuǎn)基因油菜。本研究的完成,可望為轉(zhuǎn)基因作物生物安全性的控制提供一個應(yīng)用于大田生產(chǎn)的技術(shù)手段。研究內(nèi)容如下:
　　 1、含有抗菌肽基因LJAMP2的刪除系統(tǒng)載體pBGP-FLP-LTP-GN的構(gòu)建
　　 擴(kuò)

3、增目的基因LJAMP2連接pCXSN載體,測序正確后,雙酶切含目的基因的克隆載體pCXSN-LJAMP2和載體質(zhì)粒pBGP-FLP-GN,將目的片段35S-LJAMP2-Nos與載體pBGP-FLP-GN酶切大片段連接,構(gòu)建成植物表達(dá)載體pBGP-FLP-LTP-GN并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,經(jīng)檢測驗證正確后,最后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105得到植物表達(dá)載體EHA105-pBGP-FLP-LTP-GN。
　　 2、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜菜

4、遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測
　　 以油菜品種中油821的下胚軸作為轉(zhuǎn)基因受體材料,利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化來源于益母草的陽離子抗菌肽基因LJAMP2,由花粉特異性啟動子基因BGP控制的刪除系統(tǒng)載體pBGP-FLP-GN,以及含有抗菌肽基因LJAMP2的刪除系統(tǒng)載體pBGP-FLP-LTP-GN。經(jīng)高濃度卡那霉素篩選培養(yǎng)后獲得油菜抗性植株。通過GUS組織化學(xué)染色和PCR驗證共獲得3個轉(zhuǎn)LJAMPP2基因油菜株系,4個轉(zhuǎn)pBGP-FLP-G

5、N基因油菜株系,1個轉(zhuǎn)pBGP-FLP-LTP-GN基因油菜株系,檢測結(jié)果均呈陽性,初步證明外源目的基因已整合到油菜基因組中。RT-PCR證實LJAMP2和FLP基因分別在轉(zhuǎn)LJAMP2和轉(zhuǎn)pBGP-FLP-GN油菜植株中均能大量表達(dá)。
　　 3、轉(zhuǎn)LJAMP2基因油菜抗病性檢測
　　 體外抑菌試驗表明,轉(zhuǎn)LJAMP2基因油菜細(xì)胞粗提液對菌核病病菌的菌絲抑制力明顯強(qiáng)于非轉(zhuǎn)基因油菜細(xì)胞粗提液。進(jìn)一步將菌核病病菌接種在轉(zhuǎn)基因

6、和野生型油菜葉片上離體培養(yǎng),結(jié)果顯示野生型植株葉片感病快且面積大,而轉(zhuǎn)LJAMP2基因植株葉片僅少面積感病。顯微鏡下觀察葉片體內(nèi)病菌菌絲侵染情況,發(fā)現(xiàn)菌核病病菌的菌絲在非轉(zhuǎn)基因油菜植株中形態(tài)正常,而在轉(zhuǎn)LJAMP2基因植株葉片中,菌絲變厚變粗,且表現(xiàn)為卷曲形態(tài),在葉片內(nèi)擴(kuò)散速度和擴(kuò)散面積也小于非轉(zhuǎn)基因植株葉片。上述抗性試驗結(jié)果表明,在油菜中超量表達(dá)LJAMP2基因能顯著提高對油菜菌核病的抗性。
　　 4、轉(zhuǎn)pBGP-FLP-GN

7、載體油菜刪除效率檢測
　　 比較處于發(fā)育相同階段的野生型花粉粒,以及轉(zhuǎn)LJAMP2基因油菜花粉粒的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果,可初步證實在轉(zhuǎn)pBGP-FLP-GN基因油菜的花粉粒中已實現(xiàn)基因刪除。進(jìn)一步比較轉(zhuǎn)pBGP-FLP-GN基因油菜不同階段花粉粒染色結(jié)果,顯示花粉粒顏色由藍(lán)色逐漸朝黃色變化。對所有計數(shù)花粉粒進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)pBGP-FLP-GN載體油菜刪除效率為82.51%。上述結(jié)果表明,含有pBGP-FLP-GN載體