轉(zhuǎn)基因油菜檢測技術(shù)與環(huán)境安全性研究.pdf

1、Ms8Rf3是由德國拜耳公司利用轉(zhuǎn)基因不育系Ms8(轉(zhuǎn)Barnase與Bar基因)和轉(zhuǎn)基因恢復(fù)系Rf3(轉(zhuǎn)Barstar與Bar基因)培育的抗草胺膦雜交油菜，在加拿大的種植面積已占油菜播種總面積的45％以上。近年來，Ms8Rf3種子通過進(jìn)口貿(mào)易，大量輸入我國。然而，該品種是否對我國生態(tài)環(huán)境是否產(chǎn)生不良影響，以及如何對該品種進(jìn)行檢測和監(jiān)管尚缺乏技術(shù)手段和證據(jù)。 本研究的目的是建立Ms8Rf3轉(zhuǎn)化事件特異性檢測方法和ELISA檢測手

2、段，評價該品種在我國生態(tài)環(huán)境中的遺傳穩(wěn)定性以及向我國主要蔬菜和油菜發(fā)生基因擴(kuò)散的可能性，為我國轉(zhuǎn)基因油菜的安全管理提供技術(shù)手段和科學(xué)依據(jù)。 根據(jù)轉(zhuǎn)基因植物外源基因插入位點的特異性，破譯了Ms8Rf3外源基因插入位點兩側(cè)的DNA序列，通過設(shè)計轉(zhuǎn)化事件特異性引物和構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，成功構(gòu)建了針對Ms8Rf3的高效檢測體系。該方法能準(zhǔn)確判定樣品中是否含有來自雄性不育系Ms8、育性恢復(fù)系Rf3或者轉(zhuǎn)基因油菜雜交種Ms8Rf3的轉(zhuǎn)基因成

3、分，為轉(zhuǎn)基因油菜監(jiān)管提供了技術(shù)支持并填補(bǔ)了該領(lǐng)域空白。 本研究實現(xiàn)了外源基因bar在大腸桿菌中的表達(dá)，獲得了純化的PAT蛋白。該蛋白可以替代轉(zhuǎn)基因植物的外源蛋白，用于轉(zhuǎn)bar基因產(chǎn)品的食用安全性分析，也可用于轉(zhuǎn)bar基因產(chǎn)品ELISA檢測時的抗體制備。通過PCR擴(kuò)增，從pCAMBIA1300-bar質(zhì)粒中獲得bar基因編碼區(qū)全長，經(jīng)酶切鑒定和測序后，證實了bar基因分離成功。用BamHI和HindⅢ酶切，將bar基因與載體pET

4、28a連接，構(gòu)建成重組載體pET28bar。將重組載體pET28bar轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21(DE3)后，獲得高效表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析顯示，目的蛋白主要以包涵體形式存在，蛋白質(zhì)分子量約為27KDalton。將包涵體離心、洗滌和純化后，得到高純度的目的蛋白。 采用人工雜交和熒光顯微鏡觀察甘藍(lán)型油菜花粉在近緣種柱頭上的萌發(fā)生長情況，探討了甘藍(lán)型油菜的基因擴(kuò)散到其它物種的可能性。結(jié)果表明，A基因組物種和AB基因組物種與甘藍(lán)

5、型油菜都具有不同程度的親和性，其中烏塌菜和小葉雪里蕻的親和指數(shù)較高(分別為0.370和0.335)。在大田自然授粉條件下，轉(zhuǎn)基因油菜與相鄰種植的蕓薹屬近緣作物異交率分析表明：13個蕓薹屬物種中有12個品種不同程度的與Ms8Rf3花期相遇，并且均能檢測到異交。天然異交率最高的品種是甘藍(lán)型油菜波利馬不育系和中油821(異交率分別是3.598％和0.642％)。 為了檢測Ms8Rf3的遺傳穩(wěn)定性，本研究對Ms8Rf3的F1代和F2代群