兩種蜘蛛毒素的活性機(jī)制和應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、海南捕鳥蛛（Haplopelma hainanum[Selenocosmia hainana]）主要分布于我國南方地區(qū)的山林地帶，體型較大，能夠捕食鳥類和小型哺乳動(dòng)物。海南捕鳥蛛毒素-Ⅰ(HNX-Ⅰ)是分離自海南捕鳥蛛毒液的一種神經(jīng)毒素，首先通過電刺激蜘蛛螯肢采集毒液，經(jīng)過冷凍干燥之后得到干粉，然后采用陽離子交換和反相高效液相色譜分離純化得到單一組分HNTX-Ⅰ。采用膜片鉗技術(shù)鑒定了該毒素分子對(duì)中電導(dǎo)鈣離子激活鉀通道(intermedi

2、ate-conductance calcium-activatedpotassium channel，IK)門控特性的影響。HNTX-Ⅰ含有33個(gè)氨基酸殘基，6個(gè)半胱氨酸(Cys)形成3對(duì)二硫鍵，一級(jí)序列包含兩個(gè)相鄰的半胱氨酸，二硫鍵配對(duì)方式為Ⅰ-Ⅳ、Ⅱ-Ⅴ、Ⅲ-Ⅵ，相對(duì)分子質(zhì)量為3607.1 Da，是海南捕鳥蛛毒液中豐度最高的組分。HNTX-Ⅰ可以激活I(lǐng)K通道的開放，IK通道在血管上皮細(xì)胞的舒張過程中發(fā)揮重要作用，其功能受損可能會(huì)導(dǎo)致

3、高血壓等心腦血管疾病的發(fā)生。并且HNTX-Ⅰ對(duì)于大鼠背根神經(jīng)節(jié)上的電壓門控鈉通道、鈣通道和HEK293T細(xì)胞上異源表達(dá)的電壓門控慢激活延遲整流鉀通道均無明顯效果;對(duì)于同源性較高的小電導(dǎo)(small-conductancecalcium-activated potassium channel，SK)鈣離子激活鉀通道，飽和劑量的HNTX-Ⅰ也只能產(chǎn)生微弱的激活效果，而對(duì)同一家族的另一成員——大電導(dǎo)(big-conductance calci

4、um-activated potassium channel，BK)鈣離子激活鉀通道，HNTX-Ⅰ則幾乎沒有作用。同時(shí)，通過小鼠膈肌-膈神經(jīng)標(biāo)本和毒理學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)HNTX-Ⅰ不會(huì)阻斷神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)，也沒有明顯的致死性。實(shí)驗(yàn)證明了HNTX-Ⅰ能夠?qū)Ｒ恍约せ領(lǐng)K通道，并沒有產(chǎn)生明顯的毒副作用。
　　敬釗纓毛蛛（Chilobrachys guangxiensis[Chilobrachys jingzhao]）是發(fā)現(xiàn)于我國海南省的一種捕

5、鳥蛛，敬釗纓毛蛛毒素-Ⅴ(JZTX-Ⅴ)是從該蜘蛛毒液中分離得到的一種廣譜神經(jīng)毒素，能夠抑制大多數(shù)的電壓門控鈉通道和鉀通道，并且已有實(shí)驗(yàn)證明，該毒素能夠和磷脂發(fā)生相互作用。本研究采用固相多肽合成得到JZTX-Ⅴ毒素，并將合成的線性產(chǎn)物氧化復(fù)性，再采用羅丹明B(Rhodamine B)熒光標(biāo)記。通過膜片鉗實(shí)驗(yàn)和圓二色譜(circular dichroism，CD)檢測(cè)，結(jié)果表明帶有熒光標(biāo)記的JZTX-Ⅴ(R-JZTX-Ⅴ)的電生理活性和二

6、級(jí)結(jié)構(gòu)基本和天然毒素分子相同，從而證明熒光標(biāo)記并未對(duì)毒素分子的功能和結(jié)構(gòu)造成顯著影響。我們通過毒素?fù)p耗實(shí)驗(yàn)證明了JZTX-Ⅴ能夠和活體細(xì)胞膜發(fā)生相互作用，然后使用全內(nèi)反射熒光顯微鏡(total internal reflection fluorescence microscopy，TIRFM)追蹤了帶有熒光標(biāo)記的單個(gè)JZTX-Ⅴ毒素分子在活細(xì)胞膜表面運(yùn)動(dòng)的軌跡。通過軌跡的分析，我們發(fā)現(xiàn)了單個(gè)毒素分子在細(xì)胞膜表面主要存在三種運(yùn)動(dòng)模式:即無

7、規(guī)則的快速活動(dòng)、限定區(qū)域的低速運(yùn)動(dòng)和相對(duì)于膜表面靜止?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)，我們建立了一種直觀研究毒素分子和細(xì)胞膜相互作用的方法，并初步闡述了毒素分子在細(xì)胞膜表面的具體運(yùn)動(dòng)情況，為研究毒素分子與膜上離子通道的相互作用奠定了基礎(chǔ)。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了HNX-Ⅰ對(duì)于Ⅸ通道的激活效果，并探討了二者作用的機(jī)制，這是首次發(fā)現(xiàn)IK通道的多肽類激活劑。我們利用JZTX-Ⅴ研究單個(gè)毒素分子與活體細(xì)胞膜表面的相互作用，是第一次在活細(xì)胞體系運(yùn)用單分子