BRD7基因在小鼠各組織中的表達(dá)及基因敲除小鼠模型的構(gòu)建.pdf

1、BRD7是本室自主克隆的一個(gè)鼻咽癌候選抑瘤基因,具有阻止細(xì)胞周期G1-S期進(jìn)程、始動(dòng)細(xì)胞凋亡、逆轉(zhuǎn)細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的特征。該基因能結(jié)合和識別乙酰化組蛋白H3,是Bromodomain家族成員之一。BRD7通過參與ras/MEK/ERK、Rb/E2F和Wnt等多條信號通路實(shí)現(xiàn)抑瘤功能,是一個(gè)在鼻咽癌發(fā)病過程中與細(xì)胞周期和凋亡密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。盡管BRD7基因抑瘤功能和作用機(jī)制研究已經(jīng)取得了突破性的進(jìn)展,但仍然缺乏強(qiáng)有力的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2、依據(jù)。
　　新近發(fā)展的基因敲除技術(shù)是利用同源重組原理使特定的靶基因失活進(jìn)而實(shí)現(xiàn)在其功能缺失的情況下分析靶基因功能的方法。通過基因剔除,可以從整體和細(xì)胞水平上反映基因剔除后一系列表型的改變。為此,本課題以C57BL/6小鼠為研究模型,一方面系統(tǒng)比較鼠源性BRD7與人BRD7基因在mRNA序列和氨基酸序列上的同源性,并研究其在小鼠全身各組織中的表達(dá)規(guī)律；另一方面利用Cre/LoxP系統(tǒng),探索基因剔除小鼠模型構(gòu)建和鑒定的方法,構(gòu)建BRD

3、7條件性剔除小鼠模型,為體內(nèi)研究BRD7的抑瘤功能、全面考察BRD7參與正常生理、疾病發(fā)生的功能和機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　一.鼠源性BRD7的序列特征和表達(dá)
　　1.鼠源性BRD7的序列特征
　　C57BL是小鼠的一個(gè)品系,是一種常見的基因剔除研究動(dòng)物模型。C57BL小鼠BRD7(mBRD7)的編碼框序列為1956bp,含17個(gè)外顯子,編碼651個(gè)氨基酸。人BRD7(hBRD7)的編碼框序列同為195

4、6bp,含13個(gè)外顯子,亦編碼651個(gè)氨基酸。mBRD7的mRNA和氨基酸序列與hBRD7的同源性均高達(dá)88％,說明C57BL小鼠中BRD7發(fā)揮的功能與人體組織中BRD7發(fā)揮的功能類似,是BRD7基因剔除小鼠構(gòu)建的最佳小鼠品系。
　　2.mBRD7在小鼠全身各組織中的表達(dá)規(guī)律研究
　　通過數(shù)字化表達(dá)分析(電子雜交),mBRD7在腦、眼睛、心臟、肝、肺、胰腺、皮膚、睪丸、腸、血液、骨和前列腺等表達(dá)水平較高,在肌肉、唾液腺、胃等

5、組織中表達(dá)較低,是一個(gè)存在廣泛表達(dá)的保守基因。進(jìn)一步通過熒光定量PCR檢測,發(fā)現(xiàn)mBRD7的平均CT值為24.2個(gè)循環(huán),GAPDH的平均CT值為19.0個(gè)循環(huán),其mRNA表達(dá)水平是GAPDH的1/36.76。BRD7在小鼠全身各組織中整體表達(dá)處于中低度水平,呈泛表達(dá),但在睪丸、附睪、精囊腺、生精管等雄性生殖相關(guān)的組織以及脾、肺、外耳等組織中表達(dá)較高,推測BRD7可能與小鼠雄性生育存在某種關(guān)聯(lián)。
　　二.BRD7基因剔除小鼠模型的構(gòu)

6、建
　　1.BRD7LoxP1-2+/-小鼠的構(gòu)建和鑒定
　　LoxP插入的雜合子小鼠(Flox小鼠)是條件性基因剔除小鼠過程中的重要步驟,系與上海南方模式生物研究中心合作完成。整個(gè)制備過程包括條件性打靶載體的構(gòu)建、胚胎干細(xì)胞的基因打靶、陽性ES細(xì)胞克隆的篩選、重組ES細(xì)胞囊胚腔注射、嵌合體小鼠的獲得等,通過毛色和基因型鑒定獲得LoxP插入的雜合子小鼠(BRD7.LoxP1-2+/-小鼠)。在獲得BRD7LoxP1-2+/-

7、小鼠的基礎(chǔ)上,抽提小鼠尾巴gDNA,分別采用兩對針對LoxPl.LoxP2位點(diǎn)的引物和針對野生型等位基因(WT)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序鑒定,證實(shí)BRD7LOxP1-2+/-小鼠構(gòu)建成功。
　　2.BRD7LoxP3+/+小鼠的構(gòu)建和鑒定
　　取BRD7LoxP1-2+/-小鼠雌雄雜交,分別以子代鼠gDNA為模板,采用針對LOxPl.LoxP2和WT的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定,獲得基因型為BRD7LoxP1-2+/+小鼠；然

8、后與EⅡ-Cre+/+小鼠雜交,通過PLoxPl、PLoxP2、PLoxP3、PWT和PCre五對引物對子代鼠進(jìn)行PCR擴(kuò)增和鑒定,獲得基因型為BRD7LoxP3+/-Cre+/-小鼠；再進(jìn)一步與基因型為BRD7loxP1-2+/-Cre-/-小鼠雜交,獲得基因型為BRD7loxP3+/+即理論上的BRD7-/-小鼠。
　　3.BRD7基因剔除(KO)小鼠的鑒定
　　在成功構(gòu)建BRD7LoxP3+/+(BRD7-/-)小鼠的

9、基礎(chǔ)上,采用PLoxP3引物通過PCR擴(kuò)增LoxP3片段,膠回收純化片段后直接測序,從gDNA層面證實(shí)BRD7的3-4號外顯子被成功剔除；進(jìn)一步以基因型為BRD7LoxP1-2+/+和基因型為BRD7LoxP3+/+小鼠為研究模型,抽提大腸組織總RNA并逆轉(zhuǎn)錄,以BRD7全長引物和專針對Exon3-4外顯子的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物的測序鑒定,從mRNA片段大小和序列特征方面證實(shí)BRD7基因剔除小鼠構(gòu)建成功；最后隨機(jī)抽取野生型小鼠和基因

10、剔除小鼠各兩只,抽提脾臟總RNA并逆轉(zhuǎn)錄,從mRNA和多組織層面證明BRD7剔除小鼠構(gòu)建成功。
　　4.BRD7基因剔除小鼠的大量繁殖
　　為了避免Cre本身對小鼠表型的影響,選擇BRD7loxP3+/LoxP1-2+EⅡ-Cre-/-小鼠同胞對之間進(jìn)行雜交,大量繁殖BRD7基因剔除小鼠。目前已獲得BRD7-／-小鼠36只,BRD7+/-小鼠82只,BRD7+/+小鼠90只,為全面探討B(tài)RD7在小鼠中表型和分子機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)

11、基礎(chǔ)。
　　綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了C57BL小鼠中BRD7與人BRD7具有高度的同源性,均編碼651個(gè)氨基酸,在小鼠全身各組織中泛表達(dá),但在睪丸、附睪、精囊腺、生精管等雄性生殖相關(guān)的組織以及脾、肺、外耳等組織中表達(dá)較高。以C57BL小鼠為模型,采用Cre/LoxP系統(tǒng)構(gòu)建了BRD7基因剔除小鼠模型,探索了一種基因剔除小鼠構(gòu)建和鑒定的有效方法,大量繁殖了一批BRD7剔除小鼠、雜合子小鼠和野生型小鼠,為全面研究BRD7在體內(nèi)參與正常生