FMR1基因敲除小鼠腦組織中SPAR的表達.pdf

1、脆性X綜合征(fragileXsyndrome，F(xiàn)XS)是一種常見的遺傳性智力低下性疾病，臨床表現(xiàn)主要有不同程度的智力障礙、青春期后巨大睪丸、部分患者有特征性面容，如長臉、招風耳、高腭弓，以及自閉癥等精神行為異常。FXS是由脆性X智障基因(fragileXmentalretardation1，F(xiàn)MR1)中5端非編碼區(qū)CGG三核苷酸重復序列不穩(wěn)定擴增及其異常甲基化，使FMR1基因失活，導致其編碼的產物—脆性X智力低下相關蛋白(fragil

2、eXmentalretardationprotein，F(xiàn)MRP)表達的缺失或減少引起。形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)脆性X綜合征患者和FMR1基因敲除小鼠樹突棘成熟和修剪障礙，樹突棘呈明顯瘦長、扭曲的幼稚形態(tài)，不成熟的樹突棘形成突觸的能力嚴重受損。對FMR1基因敲除小鼠的電生理研究發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)代謝性谷氨酸受體(metabotropicglutamatereceptor，mGluR)所觸發(fā)的長時程抑制(Long-termDepression，LTD)延長，

3、長時程增強(Long-termPotentiation，LTP)不變。上述研究從結構和功能兩方面都表明FMRP缺乏可導致突觸可塑性改變，故目前認為其可塑性的改變是產生脆性X綜合征智能低下的主要機理，但是FMRP如何影響突觸可塑性至今仍不清楚。目前已知FMRP是一種mRNA結合蛋白，F(xiàn)MRP在細胞核與細胞質之間穿梭，改變與其結合的mRNA的亞細胞定位，影響轉錄過程及翻譯后修飾，調節(jié)蛋白的表達，推測FMRP可能通過調節(jié)與神經系統(tǒng)結構和功能有

4、關的蛋白來影響突觸的可塑性，有研究表明在行為依賴的突觸活動中FMRP的含量增高，也提示FMRP在突觸可塑性中起重要作用。由于樹突棘的改變是脆性X綜合癥的主要病理變化，且樹突棘是構成哺乳動物中樞神經系統(tǒng)興奮性突觸傳遞的主要部位，因而尋找受FMRP調節(jié)的mRNA，并探討其編碼蛋白在樹突棘發(fā)育及突觸可塑性中的作用，對明確FXS的發(fā)病機制可能有重大意義。 近年新發(fā)現(xiàn)的棘相關的Rap三磷酸鳥苷酶激活蛋白(Spine-associatedR

5、apGAP，SPAR)被發(fā)現(xiàn)與樹突棘形態(tài)有關。已知樹突棘主要構成興奮性突觸后膜，而SPAR也定位于突觸后膜。樹突棘的主要成分actin在維持棘的形態(tài)中起主要作用，研究表明SPAR具有與actin相聯(lián)系的結構域(act1，act2)，SPAR還可以通過結構域GKBD與PSD-95相聯(lián)系，而PSD-95被發(fā)現(xiàn)與樹突棘密切相關。因此，我們有充足的理由推測SPAR與樹突棘密切相關。本研究擬通過觀察不同發(fā)育時期SPAR及SPARmRNA在小鼠腦組

6、織中的表達分布，探討SPAR在腦發(fā)育中可能的作用；并通過比較KO與WT小鼠腦組織中SPAR及SPARmRNA表達的不同，探討SPAR表達是否受FMRP的影響，為研究脆性X綜合癥的發(fā)病機理提供一定的依據(jù)。 [材料和方法]1.實驗動物：本研究采用的實驗動物為FMR1基因敲除型(KO)純合子(-/-)及其野生型(WT)純合子(+/+)FVB近交系小鼠。 2.實驗動物基因型鑒定：用PCR法檢測實驗小鼠的FMR1基因片斷，用免疫印

7、跡法檢測FMRP的表達。 3.檢測SPAR在小鼠腦區(qū)的表達與分布：第一部分，用免疫組化和蛋白印記法觀察SPAR在小鼠腦區(qū)中的分布及表達。將小鼠分為成年(6周)KO組(KO6W組)、成年WT組(WT6W組)、幼年(1周)KO組(KO1W組)和幼年WT組(WT1W組)4組，每組10只。分別取每組實驗動物腦組織做冰凍切片，用生物素標記、DAB顯色免疫組化法并在顯微鏡下觀察SPAR的分布及在海馬和皮層中的表達情況。分別提取每組實驗動物海

8、馬、皮層的全細胞蛋白，進行蛋白定量，將蛋白進行電泳分離、轉膜，與SPAR抗體反應后，應用化學發(fā)光劑對蛋白進行檢測。第二部分，海馬神經元培養(yǎng)后用蛋白印跡法檢測SPAR的表達。將新生小鼠分為KO組和WT組分布進行海馬神經元的原代培養(yǎng)，共培養(yǎng)10批。培養(yǎng)到第7天后每組神經元各取部分抽提蛋白，用蛋白印跡法檢測SPAR的表達。 4.檢測SPARmRNA在小鼠腦區(qū)中的分布和表達：取小鼠分為成年(6周)KO組(KO6W組)、成年WT組(WT6

9、W組)、幼年(10天)KO組(KO10d組)和幼年WT組(WT10d組)4組，每組10只。分別取腦組織做冰凍切片，用地高辛標記、DAB顯色原位雜交法檢測SPARmRNA的分布和表達。 5.圖像采集：免疫組化，原位雜交的結果用圖象分析儀分別對大腦皮質、海馬的DAB顯色的平均光密度值(meanopticaldensity，MOD)進行采集，蛋白印跡的結果用灰度分析軟件掃描所得蛋白質條帶，得出SPAR表達圖像峰面積值，與β-actin

10、表達峰面積值進行標準化處理。 6.統(tǒng)計：對兩個年齡組之間及兩個基因型之間海馬和皮層的平均光密度值及蛋白印跡所得的標準化數(shù)值用配對t檢驗比較。用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學分析，P值小于0.05為差異有顯著性。 [結果]1.FVB小鼠腦區(qū)中SPAR的分布：SPAR在KO及WT小鼠各個腦區(qū)普遍表達，尤其在海馬、皮層表達豐富。大腦皮質中以紋狀皮質、運動皮質、梨狀皮質為主；海馬各區(qū)均有高密度信號，以齒狀核為主；大腦的核團中，在

11、第三腦室周乳頭體前核、丘腦、尾狀核、韁核、內囊、杏仁核等處濃染；胼胝體上僅有少量分布。 2.SPAR的表達：將不同基因型小鼠免疫組化、蛋白印跡法檢測的結果進行比較，發(fā)現(xiàn)KO6W組及KO1W中皮質、海馬部位SPAR的表達均顯著低于野生型，在培養(yǎng)的海馬神經元中KO組SPAR表達顯著低于WT組。不同年齡組比較，KO1W組及WT1W組中皮質、海馬部位SPAR的表達顯著高于KO6W組及WT6W組。P值均小于0.05。 3.SPAR

12、mRNA的表達：不同基因型比較，KO6W組及KO10d中皮質、海馬部位SPARmRNA的表達均顯著低于野生型。不同年齡組比較，KO10d組及WT10d組中皮質、海馬部位SPARmRNA的表達顯著高于KO6W組及WT6W組。P值均小于0.05。 [結論]SPAR及SPARmRNA在FVB小鼠各個腦區(qū)中普遍表達，在海馬、皮層等神經元聚集處表達尤為豐富。在幼年小鼠中表達高而成年小鼠中降低，表明SPAR的表達與年齡相關。FMR1基因敲除