mGluR5拮抗劑MPEP對FMR1基因敲除小鼠神經(jīng)元樹突棘的影響及機制探討.pdf

1、脆性X 綜合征是最常見的遺傳性智力低下性疾病之一，臨床癥狀表現(xiàn)為不同程度的智力低下、注意力缺陷、強迫癥、自閉癥等。FMR1 基因(fragile X mentalretardation 1)三核苷酸重復序列異常擴增，使其編碼產(chǎn)物脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein，F(xiàn)MRP)減少或缺失而致病。研究發(fā)現(xiàn)脆性X綜合征患者和FMR1基因敲除小鼠都存在樹突棘發(fā)育異常。由于樹突棘是突觸后膜的

2、主要結(jié)構(gòu)，因此普遍認為樹突棘形態(tài)異常導致的突觸可塑性改變可能是導致脆性x綜合征臨床表現(xiàn)的病理基礎(chǔ)。現(xiàn)在已證實FMRP是一種翻譯抑制因子，它特異性與某些mRNA結(jié)合抑制其蛋白的表達，推測FMRP可能通過調(diào)節(jié)與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)的蛋白合成來發(fā)揮作用。已證實FMRP蛋白包含有MAP1B mRNA結(jié)合位點，也有研究表明脆性 X 綜合征果蠅和小鼠模型腦組織中微管相關(guān)蛋白1B(microtubule associated protein 1B，MAP

3、1B)的含量增加，增加的MAP1B與樹突棘的發(fā)育密切相關(guān)，推測FMRP可能通過調(diào)節(jié)MAP1B的表達影響樹突棘的形態(tài)。由于脆性 X 綜合征第1組代謝性谷氨酸受體 (metabotropic glutamatereceptor I，mGluR I)依賴的蛋白翻譯增強；mGluR I激動劑能使海馬神經(jīng)元產(chǎn)生類似于FMR1基因敲除小鼠的樹突棘改變，并導致實驗動物產(chǎn)生脆性 X 綜合征相似的臨床癥狀；因此推測mGluR I過度激活所致的神經(jīng)發(fā)育蛋白

4、過表達可能在脆性綜合征發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。最近的研究顯示mGluR I抑制劑能夠部分逆轉(zhuǎn)脆性X綜合征小鼠模型行為異常，改善脆性X綜合征果蠅模型求偶能力和蘑菇型樹突棘缺陷；我們的前期研究結(jié)果也己證實抑制mGluR I能部分逆轉(zhuǎn)培養(yǎng)FMR1基因敲除小鼠神經(jīng)元樹突棘形態(tài)異常和MAPlB表達異常。這些結(jié)果進一步說明脆性X綜合征存在mGluR I過度激活。然而，脆性 X 綜合征樹突棘的形態(tài)異常是否由于mGluR I過度激活使MAPlB過表達所

5、致，在體的情況下mGluR I拮抗劑是否也可以逆轉(zhuǎn)FMR1基因敲除小鼠樹突棘發(fā)育異常，不同干預時機和干預時間的長短對樹突棘發(fā)育有無影響，有待進一步研究。mGluR I包括mGluR1和mGLuR5兩種亞型，最近的幾項研究提示mGlLuR5可能在脆性X綜合征的發(fā)病機制中發(fā)揮更重要的作用。因此，本研究通過給予新生和成年FMR1基因敲除小鼠mGluR5特異性拮抗劑MPEP處理，觀察mGluR5功能改變對樹突棘發(fā)育和MAP1B表達的影響，初步探

6、討mGluR5在脆性X綜合征發(fā)病機制中的作用及機理；同時通過在體條件下觀察MPEP不同干預時機和干預時間長短對樹突棘發(fā)育的影響，為尋找有效的治療方案提供一定的依據(jù)。 材料與方法： FVB品系小鼠飼養(yǎng)在19～21℃自然光條件下，自由獲取食物和水分。實驗前取尾靜脈血提取DNA，PCR技術(shù)進行基因型鑒定。將新生1天和出生6周(成年)的雄性FMR1基因敲除(FMR1 knockout，KO)小鼠分別隨機分為干預1周組(KOtlw

7、)和1周空白對照組(KOclw)、干預2周組(KOt2w)和2周空白對照組(KOc2w)。并以同齡野生小鼠(wild type mouse，WT)作為野生對照組(WTclw、WTc2w)。干預組分別于新生1天和出生6周開始給予腹腔注射MPEP 20mg/(kg．d)，兩對照組則予等量生理鹽水腹腔注射，每天1次。新生K0小鼠增設(shè)MPEP干預1天組(KOtld)，自出生第1天開始注射生理鹽水，第7天給予MPEP注射1次。以上各組注射時間固定

8、于上午10：00～11：00。新生小鼠每組10只，Golgi染色和免疫印跡兩種試驗方法各用5只；成年小鼠每組5只，用于Golgi染色。用于Golgi染色的實驗小鼠在接受最后1次注射3 h后取腦，以單片Golgi染色方法觀察樹突棘的長度、密度和形態(tài)。用于免疫印跡的新生小鼠于最后1次注射3h后抽取全腦蛋白，用免疫印跡方法檢測MAP1B的表達。 結(jié)果： 1．KO和WT小鼠樹突棘特點在新生和成年KO鼠的空白對照組(KOc，包括K

9、Oclw和KOc2w)與同齡野生對照組相比樹突棘長度都明顯增長(P<0.05)，不成熟樹突棘比例顯著增加(P<0.05)。除新生鼠2周的空白對照組(KOc2w)外，其它KOc組較同齡WTc組樹突棘密度顯著增加(P<0.01)。 2．MPEP對成年和幼年KO小鼠樹突棘發(fā)育的影響 2．1 MPEP對KO小鼠樹突棘長度的影響對于新生KO小鼠，MPEP 1天干預不改變樹突棘的長度(P>0.05)；MPEP連續(xù)干預1周樹突棘長度較

10、空白對照組明顯縮短(P<0.01)，但與野生對照組仍有差異(P<0.05)；連續(xù)干預2周較空白對照組顯著縮短(P<0.01)，與野生對照組無明顯差別(P>0.05)。對于成年KO小鼠，MPEP連續(xù)干預1周、2周樹突棘長度均無改變(P>0.05)。 2．2 MPEP對KO小鼠樹突棘密度的影響對于新生KO小鼠，MPEP 1天干預不影響樹突棘密度(P>0.05)，MPEP干預1周可使樹突棘密度較空白對照組顯著降低(P<0.05)，與野

11、生對照無明顯差別(P>0.05)；MPEP干預2周對樹突棘密度無影響(P>0.05)。對于成年KO小鼠，MPEP干預1周不影響樹突棘的密度(P>0.05)，干預2周可使樹突棘密度明顯降低(P<0.05)。 2．3 MPEP對KO小鼠樹突棘形態(tài)的影響給予新生KO小鼠MPEP干預1周、2周均可使其不成熟樹突棘比例明顯減少(P<0.05)，成熟樹突棘比例顯著增加(P<0.05)；MPEP 1天干預不改變KO小鼠樹突棘的形態(tài)(P>0.0

12、5)。對于成年KO小鼠，MPEP干預1周、2周對樹突棘的形態(tài)影響不明顯(P>0.05)。 3．MPEP對幼年KO小鼠腦內(nèi)MAP1B表達的影響新生KO鼠1周和2周的空白對照組MAP1B的表達較同齡WTc小鼠顯著增加(P<0.01)。MPEP干預1次可明顯減少1周空白對照組MAP1B的表達(P<0.05)；給予新生KO小鼠MPEP干預1周、2周均可使MAP1B的表達有更明顯的降低(P<0.01)，與野生對照已無明顯差別(P>0.05

13、)。 小結(jié)： 1．幼年和成年的FMR1基因敲除小鼠均表現(xiàn)不成熟的樹突棘增多，樹突棘增長和密度增加，表明FMRP在樹突棘發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，其表達缺失可導致樹突棘發(fā)育異常。 2．MPEP干預1周和2周可明顯逆轉(zhuǎn)新生FMR1基因敲除小鼠樹突棘長度及形態(tài)異常，干預1周FMR1基因敲除小鼠樹突棘密度明顯降低。這提示脆性X綜合征樹突棘發(fā)育異常與FMRP缺失導致mGluR5信號過度激活有關(guān)，這可能是mGluR5拮抗劑發(fā)揮

14、治療作用的基礎(chǔ)。 3．FMR1 基因敲除小鼠MAP1B表達顯著增加，MPEP干預可以明顯降低FMR1基因敲除小鼠MAP1B表達，表明mGluR5可能通過調(diào)節(jié)MAP1B的表達影響樹突棘發(fā)育。 4．MPEP對新生鼠的干預有效，而對成年FMR1基因敲除小鼠樹突棘形態(tài)影響不明顯，提示mGluR5信號過度活動主要影響幼年FMR1基因敲除小鼠樹突棘發(fā)育。MPEP 1次干預不影響樹突棘的形態(tài)，表明mGluR5信號影響樹突棘發(fā)育需要較長