GSK-3β、mTOR在Fmr1基因敲除小鼠脊髓水平的痛覺(jué)調(diào)制中的作用.pdf

1、脆性X綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是一種常見(jiàn)的遺傳性智力低下疾病，它的遺傳學(xué)基礎(chǔ)是由于X連鎖的脆性X智力低下一號(hào)基因（fragile X mental retardation gene1，F(xiàn)mr1）5’端的(CGG)n三核苷酸重復(fù)序列擴(kuò)增異常及與其相鄰的CpG島異常甲基化,致使Fmr1基因編碼的產(chǎn)物脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein，F(xiàn)MRP)缺如或減少

2、所致。脆性X綜合征有一個(gè)顯著的特點(diǎn)是患者有痛覺(jué)敏感性下降導(dǎo)致的自我傷害行為。還有不同程度的智力低下,學(xué)習(xí)記憶力減退，活動(dòng)過(guò)度，以及癲癇患病率增高等癥狀。而Fmr1基因敲除小鼠（Knockout mice，KO鼠）也有許多上述類似表現(xiàn)。因此，我們推測(cè)Fmr1基因敲除小鼠痛覺(jué)處理系統(tǒng)異常，可能存在痛覺(jué)敏感性下降。目前，F(xiàn)XS患者的自殘行為的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制尚不明了，本研究小組的前期研究發(fā)現(xiàn) Fmr1基因敲除小鼠皮層和海馬的絲氨酸-磷酸化-糖原

3、合成酶激酶-3（serine-phosphorylation of GSK3，P-GSK3）表達(dá)減少，鋰劑可以通過(guò)增加P-GSK3的表達(dá)來(lái)改善KO鼠學(xué)習(xí)記憶減退的表型。有研究顯示神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）可通過(guò)磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）信號(hào)途徑激活糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK3）而改變小鼠痛覺(jué)的

4、敏感性。在KO鼠的脊髓中P-GSK3的表達(dá)是否存在異常，KO鼠痛覺(jué)敏感性下降是否與此有關(guān)？這些問(wèn)題都有待于進(jìn)一步研究和探討。
　　有研究表明哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成，影響突觸傳遞效能，參與長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long term potentiation，LTP）的形成，介導(dǎo)痛覺(jué)的中樞敏化，從而參與病理性疼痛的形成與維持；還有研究顯示 GSK3可通過(guò)

5、TSC1/2復(fù)合體（the tuberous sclerosiscomplex1/the tuberous sclerosis complex 2）對(duì)mTOR的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)；這些研究結(jié)果提示mTOR參與了痛覺(jué)的調(diào)制并可能受到GSK3的調(diào)節(jié)。但mTOR是否參與Fmr1基因敲除小鼠痛覺(jué)異常的形成機(jī)制，與GSK3的關(guān)系又是如何？目前尚不清楚。
　　本研究旨在探索Fmr1基因敲除小鼠是否存在痛覺(jué)敏感性下降，在脊髓水平初步探索磷酸化絲氨酸-

6、9-糖原合成酶激酶-3β（phospho-Ser9-GSK3β，P-GSK3β）及mTOR在Fmr1基因敲除小鼠痛覺(jué)敏感性改變的機(jī)制中的作用及兩者之間的關(guān)系，初步探討FXS患者自殘行為的生物學(xué)機(jī)制。
　　【研究目的】
　　本研究通過(guò)對(duì)Fmr1基因敲除小鼠和野生型小鼠（Wild type mice，WT鼠）的熱刺激縮足反射潛伏期（PWTL）的測(cè)定，明確KO鼠的痛覺(jué)敏感性是否下降；同時(shí)通過(guò)免疫組織化學(xué)方法，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，觀察

7、KO鼠腰骶膨大段脊髓后角的GSK3β，P-GSK3β及mTOR的表達(dá)與WT鼠是否有差別；并了解使用GSK3抑制劑氯化鋰后，KO鼠的痛覺(jué)異常能否恢復(fù)至WT鼠的水平，脊髓中GSK3β、P-GSK3β及mTOR表達(dá)是否發(fā)生改變及它們之間的相互關(guān)系，初步探討它們?cè)贔mr1基因敲除小鼠在脊髓水平痛覺(jué)敏感性改變機(jī)制中可能的作用。
　　【材料和方法】
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：純合子（-/-）Fmr1基因敲除型（KO）及其純合子(+/+)野生型(

8、WT) FVB近交系小鼠。
　　2.動(dòng)物基因型鑒定：采用PCR法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠的Fmr1基因片段。
　　3.動(dòng)物分組：
　　3.1、用于痛覺(jué)敏感性測(cè)定的8周齡的45只KO鼠及45只WT鼠均分成空白對(duì)照組、生理鹽水組和氯化鋰組，每組15只。4周齡的小鼠只設(shè)KO組及WT組，每組15只。
　　3.2、用于免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)8周齡的12只KO鼠及12只WT鼠均分成空白對(duì)照組、生理鹽水組和氯化鋰組，每組4只。4周齡的小鼠只設(shè)K

9、O組及WT組，每組4只。
　　3.3、用于蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)8周齡的12只KO鼠及12只WT鼠均分成空白對(duì)照組、生理鹽水組和氯化鋰組，每組4只。4周齡的小鼠只設(shè)KO組及WT組，每組4只。
　　4.實(shí)驗(yàn)方法及觀測(cè)指標(biāo)：8周齡小鼠第一天測(cè)定PWTL值，作為基礎(chǔ)痛閾，第2，3，4，5天均按4mmol/kg腹腔注射氯化鋰，給藥30分鐘后測(cè)定PWTL值，第6天給藥30分鐘后灌注固定取腰骶膨大段脊髓行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，或脫臼處死取脊髓行蛋

10、白免疫印跡實(shí)驗(yàn)。4周齡小鼠只測(cè)第一天的基礎(chǔ)痛閾。觀察KO鼠與WT鼠的基礎(chǔ)痛閾是否不同，使用氯化鋰后8周KO及8周WT鼠痛覺(jué)敏感性如何變化，并通過(guò)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)及免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)8周KO及8周WT鼠用藥前后腰骶膨大段脊髓的GSK3β、P-GSK3β和mTOR的表達(dá)做定量和定性分析。
　　5.數(shù)據(jù)及圖像的采集：PWTL值通過(guò)PL-200熱刺痛儀打印；免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果用光密度法分析，免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果用光密度法（Quantity

11、One）定量，用同一塊膠上的目的蛋白與內(nèi)參蛋白測(cè)得值的比值作為統(tǒng)計(jì)分析數(shù)值。
　　6.統(tǒng)計(jì)方法：所有結(jié)果均用`X±S表示，用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析；KO與WT小鼠所有實(shí)驗(yàn)參數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；KO及WT用藥前后實(shí)驗(yàn)參數(shù)的比較采用單因素方差分析，所有的檢驗(yàn)P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
　　1.經(jīng)基因鑒定，KO組小鼠均為純合子（-/-）Fmr1基因敲除型；WT組小鼠均為純合子(+/+)野生型

12、。
　　2.行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：4周齡及8周齡KO鼠的基礎(chǔ)痛閾均比同周齡的WT鼠的基礎(chǔ)痛閾高，即4周齡及8周齡KO鼠痛覺(jué)敏感性低。8周齡KO鼠使用氯化鋰后痛覺(jué)閾值下降，且與同周齡WT鼠相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即8周齡KO鼠使用氯化鋰后痛覺(jué)敏感性恢復(fù)正常。
　　3.免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：GSK3β、P-GSK3β、mTOR廣泛表達(dá)于脊髓灰質(zhì)的神經(jīng)元的胞漿中，部分前角神經(jīng)元可見(jiàn)胞核中有P-GSK3β表達(dá)，與同周齡的WT鼠相比，4周齡

13、及8周齡 KO鼠脊髓腰骶膨大段后角邊緣層及膠狀質(zhì)的P-GSK3β、mTOR的表達(dá)明顯減少。使用氯化鋰后，8周齡 KO鼠脊髓腰骶膨大段后角邊緣層及膠狀質(zhì)的P-GSK3β及mTOR的表達(dá)均增多，而8W齡WT鼠的變化不明顯。4周齡及8周齡 KO鼠脊髓腰骶膨大段后角邊緣層及膠狀質(zhì)的GSK3β的表達(dá)和WT鼠無(wú)明顯差別。與用藥前相比，8周齡KO鼠及WT鼠脊髓腰骶膨大段后角邊緣層及膠狀質(zhì)的GSK3β的表達(dá)均無(wú)明顯改變。
　　4.免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

14、：與同周齡的WT鼠相比，4周齡及8周齡KO鼠脊髓腰骶膨大段P-GSK3β、mTOR的表達(dá)明顯減少。使用氯化鋰后，8周齡KO鼠脊髓腰骶膨大段P-GSK3β及mTOR的表達(dá)均增多，而8W齡WT鼠的變化不明顯。4周齡及8周齡KO鼠脊髓腰骶膨大段的GSK3β的表達(dá)和WT鼠無(wú)明顯差別。與用藥前相比，8周齡KO鼠及WT鼠脊髓腰骶膨大段的GSK3β的表達(dá)均無(wú)明顯改變。
　　【結(jié)論】
　　1．KO鼠熱痛覺(jué)閾值增高，熱痛覺(jué)敏感性降低。