FMR1基因敲除小鼠聽源性癲癇的生化機(jī)制及其柴胡桂枝湯揮發(fā)油的干預(yù)作用.pdf

1、目的：
　　 癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見病之一，是由多種病因引起的慢性腦性疾病，以大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電所致的突然、反復(fù)和短暫的大腦功能障礙為特征，是影響人類健康的一大類疾患。這種神經(jīng)元的異常放電與神經(jīng)遞質(zhì)失衡、離子通道、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、遺傳及免疫的異常有著密切的關(guān)系。目前對癲癇的實(shí)驗(yàn)研究，多采用傳統(tǒng)的點(diǎn)燃模式—化學(xué)點(diǎn)燃?；瘜W(xué)點(diǎn)燃的藥物主要有戊四氮、匹羅卡品、青霉素及美解眠等。
　　 臨床上對癲癇的治療，大多都是使用西藥來控制癲

2、癇的發(fā)作，但常用的西藥均具有明顯的毒副作用。中藥治療癲癇具有療效確切、毒副作用少等優(yōu)勢。柴胡桂枝湯在臨床上具有明顯的抗癲癇作用，但機(jī)理不明。明確癲癇發(fā)病機(jī)制，將有利于癲癇的診斷、預(yù)防與治療。
　　 本實(shí)驗(yàn)擬用FMR1基因敲除小鼠作為模型，從空間認(rèn)知功能、突觸重建、動物行為學(xué)、自由基產(chǎn)生與消除、氨基酸水平等方面，研究癲癇發(fā)病機(jī)制及柴胡桂枝湯對癲癇的干預(yù)作用，為該組方將來開發(fā)成為新型的抗癲癇藥物打下堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。
　　

3、 方法：
　　 1.FMR1基因敲除小鼠癲癇模型的初步研究選擇4周、6周、8周不同年齡組的正常的野生型小鼠（WT）和FMR1基因敲除小鼠（KO），以相同實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行5天的Morris水迷宮學(xué)習(xí)與記憶測試，包括前4天的定位航行實(shí)驗(yàn)和第五天的空間探索實(shí)驗(yàn)。
　　 選擇0天、2周、4周不同年齡組的正常的野生型小鼠（WT）和FMR1基因敲除小鼠（KO），用免疫組化的方法觀察EphA2在兩種鼠腦不同部位的表達(dá)。
　　 2.

4、FMR1基因敲除小鼠聽源性癲癇及柴胡桂枝湯揮發(fā)油抗癲癇生化機(jī)制的研究選擇4周齡的正常的野生型小鼠（WT）和FMR1基因敲除小鼠（KO），腹腔注射不同濃度的柴胡桂枝湯揮發(fā)油，運(yùn)用曠場實(shí)驗(yàn)方法，觀察動物行為學(xué)的指標(biāo)及建立一個有效藥物濃度曲線。
　　 將4周齡的WT和KO小鼠分別分作三組，即未作任何處理的對照組、腹腔注射植物油的空白組、腹腔注射柴胡桂枝湯揮發(fā)油的用藥組。利用鄰苯三酚自氧化法、硫代巴比妥法、硝酸還原酶法分別檢測超氧化物歧

5、化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）的水平，以用來比較三組不同處理的小鼠這三種物質(zhì)水平的改變。
　　 與此同時，我們還采用高效液相色譜的方法來檢測三組不同處理的小鼠氨基酸水平的變化，以更全面地研究癲癇發(fā)病機(jī)制。
　　 3.柴胡桂枝湯揮發(fā)油成分氣相色譜-質(zhì)譜分析利用超臨界CO2萃取技術(shù)制備柴胡桂枝湯揮發(fā)油，并用氣相色譜-質(zhì)譜方法對其進(jìn)行分析和鑒定。
　　 結(jié)果：
　　 1.Morris水迷宮試

6、驗(yàn)結(jié)果在定位航行實(shí)驗(yàn)中，4、6、8周齡FMR1基因敲除小鼠（KO）的逃避潛伏期與同周齡野生型小鼠(WT)相比有差異,較同周齡野生型小鼠逃避潛伏期延長(P<0.05)。同時，4、6、8周齡小鼠在空間探索實(shí)驗(yàn)中，穿過平臺次數(shù)的比較，KO組明顯少于WT組；停留在平臺區(qū)域所用時間的比較，KO組也明顯短于WT組(P<0.05)。
　　 2.EphA2在鼠腦中表達(dá)的結(jié)果EphA2蛋白在新生小鼠的海馬、皮層表達(dá)豐富。海馬以陽性細(xì)胞為主，尤其是

7、CA3區(qū)陽性細(xì)胞表達(dá)顯著；皮質(zhì)則是有陽性細(xì)胞和陽性纖維雙重表達(dá)。在0天、2周、4周不同年齡組的小鼠中，KO組小鼠EphA2在海馬和皮質(zhì)的表達(dá)，明顯高于WT組小鼠。（P<0.05)。
　　 3.曠場實(shí)驗(yàn)的結(jié)果未用藥的WT組和KO組小鼠比較，KO組小鼠的運(yùn)動性、興奮性、探索性明顯高于WT組小鼠。隨著柴胡桂枝湯揮發(fā)油濃度的增加，KO和WT小鼠的平均速度、運(yùn)動軌跡及穿越中央格次數(shù)均逐漸降低。
　　 4.SOD、MDA、NO水平測

8、定的結(jié)果WT空白組小鼠與WT對照組小鼠比較，WT空白組小鼠的SOD活力、MDA和NO水平均增高；WT用藥組小鼠與WT空白組小鼠比較，WT用藥組小鼠的SOD活力增高，而MDA和NO水平均降低。（P＜0.05）
　　 KO空白組小鼠與KO對照組小鼠比較，KO空白組小鼠的SOD活力降低，而MDA和NO水平均增高；KO用藥組小鼠與KO空白組小鼠比較，KO用藥組小鼠的SOD活力增高，而MDA和NO水平均降低。（P＜0.05）
　　

9、 5.氨基酸水平的測定結(jié)果WT空白組小鼠與WT對照組小鼠比較，WT空白組小鼠腦組織中γ-氨基丁酸水平和甘氨酸明顯降低，而谷氨酸水平則明顯升高；與此同時WT空白組小鼠與WT用藥組小鼠比較，WT空白組小鼠腦組織中谷氨酸水平明顯高于WT用藥組（P＜0.05）
　　 KO空白組小鼠與KO對照組小鼠比較，KO空白組小鼠腦組織中γ-氨基丁酸水平明顯降低；與此同時KO空白組小鼠與KO用藥組小鼠比較，KO空白組小鼠腦組織中谷氨酸水平明顯高于KO

10、用藥組（P＜0.05）
　　 6.柴胡桂枝湯揮發(fā)油的氣相色譜-質(zhì)譜分析（GC – MS）結(jié)果經(jīng)GC-MS分析，確定并鑒定出了其中的28種組分。其中,揮發(fā)油組分中,最主要的成分姜辣素占31.94％ （其中姜烯占19.75％、α-姜黃烯占7.36％、順式-6-姜烯酚占4.83％）,丁香酚占18.01％，單萜類物質(zhì)占12.34％（其中β-倍半水芹烯占7.98％、β-紅沒藥烯占3.90％、α-可巴烯占0.46％），3-丁基-1(3H)-

11、異苯并呋喃酮（又名丁基苯酞）占9.34％ ,肉桂類物質(zhì)占8.03％。
　　 結(jié)論：
　　 1.本實(shí)驗(yàn)采用的FMR1基因敲除癲癇小鼠模型類似人類的癲癇發(fā)作，且具備學(xué)習(xí)和記憶能力缺損，是研究癲癇比較理想的動物模型。EphA2受體是一種軸突導(dǎo)向分子，可能參與了腦組織結(jié)構(gòu)軸突出芽和突觸重構(gòu)的過程，為FMR1基因敲除小鼠易發(fā)癲癇提供了一條新的思路。
　　 2.FMR1基因敲除小鼠聽源性癲癇可能與興奮性氨基酸/抑制性氨基酸的

12、比例失衡相關(guān)，同時大量自由基的產(chǎn)生、過氧化物生成及NO神經(jīng)毒性也可能在致癇過程中起到了一定的作用。
　　 3.柴胡桂枝湯揮發(fā)油的抗癲癇作用可能與降低興奮性氨基酸/抑制性氨基酸的比值有關(guān)，再者其有效清除自由基、阻止過氧化物生成，減少NO的神經(jīng)毒性等藥理作用，在一定程度上，能減少癲癇發(fā)作的次數(shù)，具有保護(hù)腦細(xì)胞的作用。
　　 4.柴胡桂枝湯揮發(fā)油中姜辣素、單萜類物質(zhì)、丁基苯酞、丁香酚等主要成分可能在柴胡桂枝湯揮發(fā)油的抗氧化與抗