母體邊緣性碘缺乏對仔鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘和樹突發(fā)育的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究通過在孕期和哺乳期用缺碘飲食喂養(yǎng)母鼠建立邊緣性碘缺乏模型，探討母體邊緣性碘缺乏是否會影響子代海馬細(xì)胞骨架的構(gòu)建，從而造成錐體神經(jīng)元樹突和樹突棘發(fā)育障礙，引起子代長時程突觸可塑性損傷。以期從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)角度闡明孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏對仔鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元發(fā)育及長時程突觸可塑性的影響和相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　一、實驗動物與分組
　　健康雌性Wistar大鼠(130-150 g)，按

2、體重隨機(jī)分成三組:對照組、邊緣性碘缺乏組和重度碘缺乏組，各組均飼以缺碘地區(qū)糧食配制的飼料，飲用加入不同濃度碘化鉀(potassium iodide，KI)的去離子水，各組雌鼠日碘攝入量分別為:7.0μg/d、5.0μg/d和1.5 tg/d。雌鼠飼養(yǎng)三個月后，與正常雄鼠交配妊娠。各組取孕鼠20-22只，于母鼠妊娠0天(gestational day，GD0)，GD13和GD19時用代謝籠收集母鼠尿液用于測定尿碘濃度(urinary io

3、dine concentration，UIC)。GD0開始直至仔鼠生后21天(postnatal day，PN21)，對照組、邊緣性碘缺乏組和重度碘缺乏組飲食同前。PN21仔鼠斷乳后，各組均以普通飼料和自來水喂養(yǎng)。
　　二、大鼠甲狀腺重及仔鼠海馬重的記錄
　　在母鼠GD19和PN21時間點(diǎn)以及仔鼠PN7、PN14、PN21和PN28時，取雙側(cè)甲狀腺組織稱重并記錄。并于取材時記錄各時間點(diǎn)仔鼠海馬重。
　　三、大鼠血清TH

4、及TSH水平測定
　　分別于母鼠GD0，GD19和PN21，仔鼠PN7、PN14、PN21和PN28時，心臟采血，靜置30 min后3000rpm離心10 min，分離血清。采用固相化學(xué)免疫發(fā)光法測定血清中游離甲狀腺素（free thyroxine，F(xiàn)T4）、總甲狀腺素(total thyroxine，TT4)、游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）和促甲狀腺激素(thyroidstimulat

5、ing hormone，TSH)水平。
　　四、仔鼠海馬長時程突觸可塑性的測定
　　在PN70-80天期間，用烏拉坦麻醉仔鼠后，固定在立體定位儀上，將刺激電極插入海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞層;記錄電極則插入海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層。作基線記錄30 min后，給予100Hz的高頻刺激。記錄并分析刺激前后群峰電位(population spike，PS)幅值和興奮性突觸后電位(field-excitatory postsynapticp

6、otential，f-EPSP)斜率變化。
　　五、仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘發(fā)育的形態(tài)學(xué)研究
　　分別于PN7、PN14、PN21和PN28時各組取4只仔鼠，快速分離新鮮腦組織。Golgi-Cox染色后觀察仔鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘的發(fā)育情況。統(tǒng)計每只動物CA1區(qū)錐體神經(jīng)元頂樹突分支上的樹突棘個數(shù)，樹突棘密度表示為每10μm單位長度樹突棘的個數(shù)。并且統(tǒng)計分析四種不同形態(tài)樹突棘的頻數(shù)。
　　六、仔鼠海馬神經(jīng)元樹

7、突棘發(fā)育相關(guān)蛋白的測定分析
　　分別于PN7、PN14、PN21和PN28時，每組選取6只仔鼠，斷頭取腦，分離海馬組織。用超速離心的方法分離G-actin與F-actin后分別測定其表達(dá)水平，并分析各組G-actin/F-actin的值。采用Western Blot方法分別測定海馬中PAK1/2/3、LIMK1、cofilin及其磷酸化蛋白和drebrin蛋白的表達(dá)水平。并通過Pull-down的方法，測定各組各時間點(diǎn)海馬中Rac

8、l蛋白活性。全自動凝膠成像分析系統(tǒng)照相，用分析軟件測得各條帶的凈光密度值。
　　七、仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突發(fā)育的形態(tài)學(xué)研究
　　分別于PN7、PN14、PN21和PN28時各組取4只仔鼠，分離新鮮腦組織。Golgi-Cox染色后觀察仔鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突分支的發(fā)育情況。用ImageJ軟件分別測量各組各時間點(diǎn)神經(jīng)元基樹突和頂樹突分支總長度并用Sholl分析方法分析樹突分支復(fù)雜性。
　　結(jié)果：
　　一、孕

9、期和哺乳期邊緣性碘缺乏不影響大鼠甲狀腺重和仔鼠海馬重
　　在母鼠GD19和PN21以及仔鼠PN7、PN14、PN21和PN28時，取雙側(cè)甲狀腺組織稱重，結(jié)果顯示孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏對母鼠和仔鼠的甲狀腺重沒有影響;與對照組和邊緣性碘缺乏組相比，重度碘缺乏組大鼠甲狀腺重明顯增加(P＜0.05)。在仔鼠出生后的各時間點(diǎn)取海馬組織稱重，發(fā)現(xiàn)孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏對仔鼠海馬重亦沒有影響，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

10、>　　二、孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏導(dǎo)致大鼠血清T4水平及尿碘濃度輕微下降
　　在母鼠GD0，GD19和PN21，仔鼠PN7、PN14、PN21和PN28時，邊緣性碘缺乏組和對照組FT3和TSH水平與對照組相比沒有明顯差異(P＞0.05)。在各時間點(diǎn)，邊緣性碘缺乏組的TT4水平均低于對照組，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在母鼠PN21，仔鼠PN21和PN28時，邊緣性碘缺乏組FT4水平顯著低于對照組(P＜0.05)。其他各時

11、間點(diǎn)，對照組與邊緣性碘缺乏組FT4水平無明顯差異。在各時間點(diǎn)時，重度碘缺乏組母鼠和仔鼠的FT3、FT4和TT4水平均顯著低于對照組，TSH水平顯著高于對照組(P＜0.05)。
　　尿碘濃度測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，邊緣性碘缺乏組母鼠尿碘濃度較對照組輕微下降。而重度碘缺乏組母鼠尿碘濃度與對照組和邊緣性碘缺乏組相比顯著降低(P＜0.05)。
　　三、孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏損傷仔鼠海馬CA1區(qū)LTP
　　PN70-80時

12、，高頻刺激后邊緣性碘缺乏組仔鼠海馬CA1區(qū)f-EPSP斜率和PS幅值增加較對照組低(P＜0.05);與對照組和邊緣性碘缺乏組相比，重度碘缺乏組f-EPSP斜率和PS幅值增加顯著降低(P＜0.05)。
　　四、孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏影響仔鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘的發(fā)育
　　在PN7、PN14、PN21和PN28時，與對照組相比，邊緣性碘缺乏組和重度碘缺乏組仔鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹突棘密度降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜

13、0.05)。重度碘缺乏組仔鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹突棘密度顯著低于邊緣性碘缺乏組(P＜0.05)。此外，與對照組比，在重度碘缺乏組中不成熟的樹突棘數(shù)目較多而成熟樹突棘則較少。邊緣性碘缺乏組與對照組相比，各類型樹突棘的比例沒有明顯差異（P＞0.05）。
　　五、孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏影響仔鼠海馬中PAKs/LIMK1/cofilin信號通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)
　　在PN7、PN14、PN21和PN28時，邊緣性碘缺乏組和重度碘

14、缺乏組仔鼠海馬中G-actin/F-actin值較對照組升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);在各時間點(diǎn)，與對照組相比，邊緣性碘缺乏組仔鼠海馬p-PAK1/2、p-LIMK1、p-cofilin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)，在PN14、PN21和PN28時，邊緣性碘缺乏組drebrin蛋白的表達(dá)水平較對照組降低（P＜0.05）。在各時間點(diǎn)，重度碘缺乏組仔鼠海馬p-PAK1/2、p-LIMK1、p-cofilin和drebri

15、n蛋白表達(dá)水平較對照組和邊緣性碘缺乏組均顯著降低(P＜0.05)。
　　六、孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏影響仔鼠海馬中Rac1蛋白活性
　　在PN7、PN14、PN21和PN28時，各組之間總Rac1蛋白表達(dá)沒有明顯差異(P＞0.05)。在各時間點(diǎn)，與對照組相比，邊緣性碘缺乏組仔鼠海馬Rac1活性下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);重度碘缺乏組仔鼠海馬Rac1活性較對照組和邊緣性碘缺乏組顯著降低(P＜0.05)。
　

16、　七、孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏影響仔鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突分支的發(fā)育
　　在PN7、PN14和PN21時，與對照組相比，邊緣性碘缺乏組仔鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞基樹突分支總長度顯著下降（P＜0.05）;PN28時，基樹突分支總長度與對照組相比沒有明顯差異(P＞0.05)。在各時間點(diǎn)，邊緣性碘缺乏組和對照組頂樹突總長度沒有明顯差異(P＞0.05)。重度碘缺乏組錐體細(xì)胞基樹突和項樹突分支總長度均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P

17、＜0.05)。與對照組比較，在PN14、PN21和PN28時，邊緣性碘缺乏組基樹突分支與同心圓的交點(diǎn)數(shù)稍有下降，而重度碘缺乏組有明顯下降。且Sholl分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，邊緣性碘缺乏組和重度碘缺乏組頂樹突分支復(fù)雜性沒有明顯改變。
　　結(jié)論：
　　1、孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏對仔鼠海馬長時程突觸可塑性造成輕度損傷。
　　2、孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏使仔鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘密度下降，其機(jī)制可能是影響海馬P