GSM 1800MHz電磁波對(duì)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育和突觸發(fā)生的影響.pdf

1、由于手機(jī)在日常生活中的普遍應(yīng)用，移動(dòng)電話全球定位系統(tǒng)(GlobalSystemforMobileCommunication，GSM)的電磁場(chǎng)(Electromagneticfields，EMF)作為潛在的有害因素引起了人們的普遍關(guān)注。由于目前公布的人類暴露于電磁波的安全標(biāo)準(zhǔn)基于熱效應(yīng)，并且沒有證實(shí)是否真的安全可靠，關(guān)于GSM電磁波是否會(huì)在生物組織中引起“非熱效應(yīng)”的爭(zhēng)論愈演愈烈。由于流行病學(xué)者發(fā)現(xiàn)大腦是手機(jī)輻照的敏感靶器官，有越來(lái)越多的

2、研究者開始在體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)中研究GSM電磁波對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的生物學(xué)效應(yīng)，并評(píng)估其對(duì)健康的危害。 關(guān)于射頻電磁場(chǎng)對(duì)大腦發(fā)育的潛在影響已有研究。用10mW/cm2的2450MHz電磁波輻照對(duì)大鼠腦的整體和組織發(fā)育沒有明顯影響；胎鼠在子宮內(nèi)接受0.4W/kg的2450MHz射頻電磁波輻照不會(huì)引起大腦組織發(fā)生的明顯改變，包括腦內(nèi)的部分RNA、DNA和蛋白水平；然而暴露在28mW/cm2的電磁波會(huì)引起大腦重量減少。研究者將日本鵪鶉的卵在5.0

3、mW/cm22.45GHz電磁波長(zhǎng)期輻照后對(duì)其小腦進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)小腦皮層發(fā)育遲滯。由于上面這些研究中采用不同比吸收率(Specificabsorption，SAR)的電磁波，許多已經(jīng)超出現(xiàn)行安全指導(dǎo)方針的閾值。目前我們對(duì)于射頻電磁波是否會(huì)在動(dòng)物大腦發(fā)育過(guò)程中引起“非熱效應(yīng)”還不能得到一致的結(jié)論。不僅如此，電磁波對(duì)大腦功能和發(fā)育影響的分子和細(xì)胞機(jī)制研究也很少。神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程中如果形態(tài)上和突觸聯(lián)系上缺乏興奮性的適應(yīng)變化，可能會(huì)導(dǎo)致行為學(xué)的改

4、變。因此，在體外培養(yǎng)神經(jīng)元進(jìn)行活細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究可以幫助我們進(jìn)一步了解微波對(duì)腦功能影響的細(xì)胞和分子機(jī)制。 神經(jīng)元樹突是接收傳入神經(jīng)元興奮性突觸聯(lián)系以及引發(fā)動(dòng)作電位之前整合突觸傳入信息的重要結(jié)構(gòu)，是神經(jīng)元之間信息交換的場(chǎng)所，其長(zhǎng)度、直徑和分支均可反映細(xì)胞的功能狀態(tài)，許多營(yíng)養(yǎng)因子和應(yīng)激都可以影響樹突的發(fā)育過(guò)程，進(jìn)而影響整個(gè)神經(jīng)環(huán)路的形成和功能。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠出生后第7到14天是神經(jīng)元樹突發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期。如在這一時(shí)期，錐體神經(jīng)元的樹突樹

5、逐漸復(fù)雜并發(fā)育成熟，樹突干上的樹突絲和生長(zhǎng)錐活躍運(yùn)動(dòng)并逐漸與突觸前末梢形成突觸。發(fā)育早期的神經(jīng)元(約出生后1周)具有眾多樹突生長(zhǎng)錐和樹突絲，它們伸縮運(yùn)動(dòng)活躍并不斷與軸突相接觸，啟動(dòng)突觸的形成。在此過(guò)程中，樹突絲逐漸被粗短穩(wěn)定的樹突棘所取代，并形成大量的興奮性突觸，其解剖學(xué)位置主要位于樹突棘。由于樹突絲的結(jié)構(gòu)細(xì)微，傳統(tǒng)的染色方法不能很好地顯示其結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)特征，對(duì)于樹突、樹突絲的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)及功能等方面還缺乏了解。 本研究在在體外培養(yǎng)

6、第五天(daysinvitro，DIV5)的原代海馬神經(jīng)元中轉(zhuǎn)染綠熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)標(biāo)記的纖維型肌動(dòng)蛋白(GFP-F-Actin)和定位在膜上的GFP(F-GFP)，用活細(xì)胞成像法觀察了培養(yǎng)海馬神經(jīng)元DIV7到DIV14的樹突生長(zhǎng)、分支復(fù)雜程度和樹突絲的運(yùn)動(dòng)性，建立了量化分析培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的樹突樹發(fā)育形態(tài)學(xué)特征的技術(shù)和方法。在此方法學(xué)基礎(chǔ)上，對(duì)DIV6到DIV14的培養(yǎng)海馬神經(jīng)元分別用

7、0.8W/kg和2.4W/kg的1800MHz、217Hz調(diào)制的電磁波進(jìn)行每天15分鐘的輻照，然后在不同時(shí)間點(diǎn)用熒光顯微鏡進(jìn)行活細(xì)胞成像，研究GSM1800MHz電磁波是否會(huì)影響神經(jīng)元的樹突發(fā)育和突觸發(fā)生。 方法：取出生一天之內(nèi)的SD大鼠做原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)，在DIV5用綠熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的纖維型肌動(dòng)蛋白(GFP-F-Actin)和定位在膜上的GFP(F-GFP)共轉(zhuǎn)染神經(jīng)元，用活細(xì)胞成像法觀察了培養(yǎng)海馬神經(jīng)元DIV7到D

8、IV14的樹突絲的密度、生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)情況，樹突生長(zhǎng)、分支復(fù)雜程度和樹突棘的形成，并對(duì)不同發(fā)育階段的形態(tài)學(xué)特征做量化分析，建立了量化分析培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的樹突樹發(fā)育形態(tài)學(xué)特征的技術(shù)和方法。在此方法學(xué)基礎(chǔ)上，培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元從DIV6開始分別暴露于2.4W/kg和0.8W/kg的GSM-1800MHz電磁波，每天暴露15分鐘，直到DIV14，取不同時(shí)間點(diǎn)用熒光顯微鏡進(jìn)行活細(xì)胞成像，于第8天觀察樹突絲的密度、長(zhǎng)度、運(yùn)動(dòng)情況；于第8、10、14

9、天分別觀察樹突分支的生長(zhǎng)情況；第14天觀察樹突棘的密度。用單因素方差分析和雙尾t檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作顯著性檢驗(yàn)。 結(jié)果：培養(yǎng)7～9天可以觀察到高密度的樹突絲活躍的運(yùn)動(dòng)，樹突絲的平均密度分別為(10.78±3.78)個(gè)/100μm、(10.68±2.96)個(gè)/100μm、(9.99±3.67)個(gè)/100μm(P＞0.05)，其中有(30.18±14.03)％到(87.36±20.88)％的樹突絲運(yùn)動(dòng)活躍(P＜0.001)；第7～14天

10、樹突樹的總長(zhǎng)度從(410.74±185.98)μm增長(zhǎng)為(1238.21±418.32)μm(P＜0.001)，樹突樹的總分支數(shù)從(18.93±7.23)支增加為(33.60±10.46)支(P＜0.001)；培養(yǎng)第14天樹突棘的密度為(37.17±6.46)個(gè)/100μm。 用2.4W/kg電磁波輻照的神經(jīng)元在第8天觀察時(shí)表現(xiàn)出樹突絲的密度明顯減少了51±5.8％(7.08±0.78/100μmvs10.7±0.62/100μ

11、m，P＜0.001)，運(yùn)動(dòng)性(以運(yùn)動(dòng)的樹突絲和樹突絲總個(gè)數(shù)的百分比來(lái)表示)顯著下降了28±6.0％(60.69±5.13％vs84.97±3.81％，P＜0.001)，而對(duì)樹突絲的平均長(zhǎng)度沒有明顯影響(11.28±0.34μmvs11.76±0.19μm，P＞0.05)；在第10天、第14天樹突分支的總長(zhǎng)度顯著降低(473.02±19.08μmvs588.39±27.55μm&1004.22±44.29μmvs1238.21±42.38

12、μm，P＜0.05)，而輻照到DIV8時(shí)對(duì)樹突樹的總長(zhǎng)度還沒有明顯的影響(382.74±19.60μmvs410.74±19.60μm，P＞0.05)；第14天樹突棘的密度與假輻照組神經(jīng)元相比明顯減少14.3±3.7％(31.81±1.33/100μmvs37.17±1.38/100μm，P＜0.05)；對(duì)樹突分支的個(gè)數(shù)沒有顯著影響(18.66±0.73vs18.93±0.76，P＞0.05(DIV8)&18.54±0.72vs20.5

13、3±0.87，P＞0.05(DIV10)&34.03±1.16vs30.60±1.06(DIV14)，P＞0.05)。另外我們分析了DIV14樹突樹每一級(jí)分支的平均長(zhǎng)度和樹突分支的個(gè)數(shù)，對(duì)大多數(shù)分支級(jí)數(shù)來(lái)說(shuō)，2.4W/kgGSM1800MHz電磁波輻照組神經(jīng)元的平均長(zhǎng)度比假輻照組要短，而輻照組神經(jīng)元樹突分支的平均個(gè)數(shù)沒有明顯變化。 0.8W/kgGSM1800MHz電磁波從DIV6輻照到DIV8(每天15分鐘)對(duì)神經(jīng)元樹突絲的密

14、度(10.79±0.87/100μmvs10.69±0.56/100μm，25.26±1.34/100μmvs25.89±1.06/100μm，P＞0.05)、長(zhǎng)度(11.46±0.25μmvs11.76±0.29μm，P＞0.05)和運(yùn)動(dòng)性(87.36±4.38％vs84.97±3.81％，P＞0.05)均沒有明顯影響；0.8W/kg輻照組神經(jīng)元的樹突棘密度沒有明顯變化(36.62±1.17/100μmvs37.17±1.38/100

15、μm，P＞0.05)；另外0.8W/kg的GSM1800MHz電磁波長(zhǎng)期輻照對(duì)神經(jīng)元的樹突樹長(zhǎng)度(437.90±20.29μmvs410.74±19.60μm，P＞0.05(DIV8)&608.26±26.29μmvs588.39±27.55μm，P＞0.05(DIV10)&1161.69±41.35μmvs1238.21±42.38μm(DIV14)，P＞0.05)和分支發(fā)育(19.14±0.73vs18.93±0.76，P＞0.05

16、(DIV8)&18.86±0.72vs20.53±0.87，P＞0.05(DIV10)&36.04±1.02vs30.60±1.06(DIV14)，P＞0.05)均沒有顯著影響。 結(jié)論：結(jié)合熒光蛋白轉(zhuǎn)染和活細(xì)胞成像的方法，可動(dòng)態(tài)、連續(xù)地觀察并定量分析發(fā)育過(guò)程中樹突絲、樹突樹和樹突棘等微細(xì)結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)特征，是體外觀察神經(jīng)元發(fā)育的理想方法。在早期發(fā)育階段用2.4W/kg的GSM1800MHz電磁波長(zhǎng)期間歇性輻照可能會(huì)影響培養(yǎng)海馬神經(jīng)