cPLA2α基因敲除小鼠的構建、繁殖與鑒定.pdf

1、目的：cPLA2α能夠高選擇性地水解膜磷脂，起始花生四烯酸和溶血磷脂級聯反應，釋放一系列炎癥因子，促進炎癥反應。本課題組前期研究發(fā)現，cPLA2α在乳腺癌和肝癌患者組織中高表達，并且cPLA2α在乳腺癌細胞運動侵襲，肝癌細胞運動及上皮間充質轉化中具有重要作用。為了系統性地研究cPLA2α在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，利用先進的TALEN技術構建了cPLA2α基因敲除小鼠模型，繁殖得到基因敲除純合子，并對其進行一系列的鑒定，最后通過體內實驗證實

2、cPLA2α在腫瘤發(fā)生和轉移中的作用。
　　方法：
　　1.分析cPLA2α基因序列，設計TALEN打靶載體，利用PCR與Golden Gate法組裝TALEN載體；
　　2.將TALEN載體體外轉錄的mRNA注射入小鼠受精卵中，經母鼠代孕及與野生型雜交后獲得TALEN敲除F0及F1代小鼠；
　　3.利用F1代基因敲除雜合子小鼠進行大規(guī)模的飼養(yǎng)繁殖；
　　4.提取幼鼠腳趾DNA，經PCR與測序后鑒定幼鼠基因

3、型，得到cPLA2α基因敲除純合子小鼠；
　　5.提取基因敲除純合子、雜合子及野生型小鼠組織蛋白，Western Blotting檢測cPLA2α蛋白表達水平，驗證基因敲除效果；
　　6.收集三種基因型小鼠的代謝物，進行UPLC/Q-TOF-MS后分析代謝組學數據，尋找組間差異較大的代謝物；
　　7.構建小鼠Lewis肺癌模型，證實cPLA2α在腫瘤生長和轉移中的作用；DEN誘導小鼠肝癌模型，研究cPLA2α在肝癌發(fā)生

4、中的作用。
　　結果：
　　1.選取cPLA2α基因中的外顯子3作為TALEN靶標，成功構建了TALEN-L和TALEN-R載體；
　　2.顯微注射后得到3只陽性F0代小鼠，與野生型雜交后得到共7只F1代雜合子小鼠，分別缺失三種片段；
　　3.利用4只F1代雜合子，經過8個月的飼養(yǎng)繁殖，總計生產34次，獲得226只幼鼠；
　　4.對每只小鼠標記及鑒定后，共得到cPLA2α基因敲除純合子小鼠36只；
　

5、　5. cPLA2α敲除純合子小鼠組織中，cPLA2α蛋白不表達，cPLA2α敲除雜合子小鼠cPLA2α蛋白表達水平比野生型低；
　　6.代謝組學結果顯示，花生四烯酸、溶血磷脂酸、前列腺素、白三烯、血栓素等代謝物在組間差異較大，可以將野生組與雜合組、純合組的樣本進行很好的區(qū)分；
　　7. Lewis肺癌模型證實，cPLA2α敲除對腫瘤的生長無明顯影響，但幾乎完全抑制了腫瘤的肝轉移；DEN在野生型和cPLA2α敲除小鼠中均成功

6、誘導了肝癌。
　　結論：
　　1.利用TALEN技術成功構建了cPLA2α基因敲除小鼠，得到F1代基因敲除雜合子；
　　2.繁殖得到了cPLA2α基因敲除純合子小鼠，為后續(xù)研究cPLA2α與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系提供了重要的動物模型；
　　3.從基因水平和蛋白水平兩個方面對基因敲除純合子小鼠進行了鑒定與驗證；
　　4.代謝組學分析了cPLA2α基因敲除所引起的代謝物改變，間接證實了基因敲除模型構建的成功，也為更