G蛋白偶聯(lián)受體48基因敲除小鼠研究.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體(G Protein-Coupled Receptor,GPCR)是參與跨膜信號(hào)傳導(dǎo)的膜受體.近年發(fā)現(xiàn)的GPCR家族新成員G蛋白偶聯(lián)受體48(GPR48/LGR4)是功能未知的孤兒受體.根據(jù)其結(jié)構(gòu)分類(lèi)于GPCR的A家族糖蛋白激素受體.目前國(guó)際上對(duì)GPR48/LGR4的研究報(bào)道屈指可數(shù),研究結(jié)果提示可能參與生殖與發(fā)育.本文通過(guò)研究GPR48/LGR4基因敲除(K0)小鼠,了解GPR48/LGR4:的分布和功能,并進(jìn)一步探討G

2、PR48/LGR4參與雄性不育的發(fā)病機(jī)制,以及它與下丘腦-垂體-性腺構(gòu)成的經(jīng)典神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)軸的關(guān)系,為尋找配體提供線索. 本研究通過(guò)對(duì)GPR48/LGR4KO小鼠的表型觀察,初步探討GPR48/LGR4的功能.用RT-PCR、原位雜交、LacZ染色方法觀察GPR48/LGR4在小鼠主要器官表達(dá)分布.通過(guò)器官體重比值,大體解剖學(xué)、組織學(xué)等形態(tài)學(xué)的方法觀察GPR48/LGR4KO雄性小鼠性腺、生殖道發(fā)育和GPR48/LGR4KO小

3、鼠圍產(chǎn)期死亡的原因.電鏡觀察不同基因型的雄性小鼠生精小管和附睪管上皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)差異.ELISA方法測(cè)定小鼠血漿LH、FSH、T水平,比較不同基因型的雄性小鼠間差異.首次通過(guò)酶標(biāo)免疫組化和熒光免疫組化方法比較GPR48/LGR4KO小鼠與野生型(WT)小鼠輸出小管和附睪管上皮細(xì)胞發(fā)育、調(diào)節(jié)與功能相關(guān)的多種蛋白表達(dá)與分布差異.首次通過(guò)建立輸精管結(jié)扎和輸出小管結(jié)扎動(dòng)物模型,模擬生精小管、輸出小管、附睪管因通道阻塞引起的上皮繼發(fā)損傷,并與K

4、0小鼠比較形態(tài)學(xué)差異本組研究發(fā)現(xiàn)在不同生長(zhǎng)時(shí)期GPR48/LGR4KO小鼠體重為對(duì)照的55﹪-80﹪,體長(zhǎng)為對(duì)照的60﹪-90﹪,均明顯低于同窩對(duì)照WT小鼠(ANOVA,P(0.01). GPR48/LGR4 K0小鼠三周存活率為32.4﹪,KO胚鼠肺泡間隔較WT鼠明顯增厚,肺泡含氣量減少.KO小鼠相對(duì)體重的尿量和飲水量分別是WT對(duì)照的2.2和1.8倍,顯著高于野生型對(duì)照(非參檢驗(yàn),P<0.001,P=0.02).雄性KO小鼠不育,雌性

5、KO小鼠生育率低.KO小鼠睪丸和附睪相對(duì)體重比值是同窩對(duì)照WT組的260﹪和15﹪,差異顯著(非參檢驗(yàn),P<0.001).K0小鼠睪丸高度腫脹畸形,附睪發(fā)育不良.組織學(xué)顯示:KO小鼠睪丸網(wǎng)、直精小管、生精小管擴(kuò)張,管腔見(jiàn)較多肉芽腫樣再生物附著于上皮,生精上皮明顯變薄；輸出小管和附睪管數(shù)目明顯減少,管腔高度擴(kuò)張,管腔中有多個(gè)肉芽腫樣物質(zhì)贅生；輸出小管和附睪管頭、體部上皮高度變矮,纖毛明顯減少,部分上皮細(xì)胞變性脫落；管周間質(zhì)明顯增生,膠原纖

6、維增多.多數(shù)附睪管的體、尾部均未見(jiàn)精子；附睪管管腔內(nèi)呈PAS染色強(qiáng)陽(yáng)性,附睪上皮細(xì)胞胞質(zhì)中PAS染色陽(yáng)性顆粒增多,基膜增厚.電鏡觀察首次發(fā)現(xiàn)KO小鼠生精細(xì)胞出現(xiàn)大量空泡,精子變形,尾部9+2微管結(jié)構(gòu)異常.支持細(xì)胞細(xì)胞收縮,體積變小,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,線粒體腫脹變形,形成空泡樣結(jié)構(gòu),核固縮,支持細(xì)胞與周?chē)骷?jí)生精細(xì)胞間隙變大,各級(jí)生精細(xì)胞脫落,部分生精上皮僅剩下支持細(xì)胞.附睪管上皮基底膜明顯增寬,形態(tài)不規(guī)整.附睪尾部亮細(xì)胞增多,胞內(nèi)吞飲小泡和溶

7、酶體樣顆粒形態(tài)異常.RT-PCR證實(shí)GPR48/LGR4mRNA在睪丸、附睪、腎上腺、垂體、下丘腦等組織廣泛表達(dá),首次發(fā)現(xiàn)睪丸組織GPR48/LGR4mRNA表達(dá)量隨小鼠年齡增加而增加.原位雜交顯示GPR48/LGR4mRNA在睪丸、輸出小管和附睪上皮分布廣泛,LacZ染色顯示GPR48/LGR4:蛋白在睪丸和附睪均表達(dá).KO和WT小鼠血漿FSH、LH、T水平無(wú)顯著性差異.酶標(biāo)免疫組化和熒光免疫組化方法發(fā)現(xiàn)KO小鼠輸出小管和附睪管上皮細(xì)

8、胞的雌激素受體α(ERα)、雌激素相關(guān)受體α(ERRα)、雄激素受體(AR)、水通道蛋白9(AQP9)、鈉鉀ATP酶α亞單位(Na-K-ATPase)、鈉氫交換器3(NHE3)表達(dá)明顯降低.上皮細(xì)胞間粘著連接標(biāo)志物E-cadherin和β-catenin表達(dá)無(wú)明顯改變.KO小鼠輸出小管細(xì)胞核增殖抗原 (PCNA) 表達(dá)明顯降低.輸精管結(jié)扎和輸出小管結(jié)扎小鼠因通道阻塞引起的生精上皮繼發(fā)損傷改變與KO小鼠相似,輸出小管和附睪管上皮變化與KO