孤兒G蛋白偶聯(lián)受體hGPCRc克隆、分析及配基篩選.pdf

1、本研究根據(jù)已有文獻(xiàn)資料和相關(guān)數(shù)據(jù)庫提供的信息，成功克隆了一個(gè)人源oGPCR新成員，命名為hGPCRc。我們首先利用RT-PCR從人結(jié)腸組織獲得hGPCRc的氨基酸編碼cDNA序列，然后又以健康志愿者外周血細(xì)胞基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了同樣大小的DNA序列，經(jīng)測序比較兩者為同一基因序列，表明該受體的基因沒有內(nèi)含子，符合多數(shù)GPCRs基因缺乏內(nèi)含子的規(guī)律；運(yùn)用生物信息學(xué)手段，利用NCBI網(wǎng)站提供的相關(guān)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明，h

2、GPCRc位于人染色體13q32.2，與小鼠、大鼠的對(duì)應(yīng)物序列同源性高達(dá)85％，但與人源其他已知基因的同源性較低，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列組成了七個(gè)跨膜區(qū)段的結(jié)構(gòu)域；進(jìn)化樹分析顯示與已知人P2Y1同源性最高也僅為36％，顯然，hGPCRc屬于人類oGPCRs的新成員。　　以RT-PCR檢測hGPCRc基因在人體部分組織器官的表達(dá)情況。結(jié)果表明，hGPCRc在胎兒較多組織均有表達(dá)，其中以腎臟、心臟和結(jié)腸等最高。另外，用構(gòu)建的GFP-hGPCRc

3、融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)一周后，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示GFP-hGPCRc轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光清晰聚集于細(xì)胞膜上，證實(shí)hGPCRc蛋白位于細(xì)胞膜并穩(wěn)定表達(dá)?！　”狙芯繕?gòu)建了pcDNA3.1(+)-hGPCRc表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞獲得CHO-hGPCRc工程細(xì)胞株，利用熒光指示劑Fluo-3檢測胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，以此判斷hGPCRc是否被所檢測化合物活化。本研究利用該篩選體系對(duì)P2Y1