孤兒G蛋白偶聯(lián)受體庫的構建以及人源白介素-6的優(yōu)化表達.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）是最大的具有重要生物學功能的膜受體家族。人類基因組編碼大約400個非嗅覺GPCRs，這些GPCRs被認為擁有內源性的配基。到目前為止，大約有120個GPCRs的內源性配基依然未被發(fā)現(xiàn)，這些GPCRs被稱為孤兒GPCRs。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質或肽類激素能夠激活大約百分之五十的擁有已知內源性配基的GPCRs，這些蛋白質或肽類激素是GPCR內源配基的最重要的組成部分。因此，我們推斷人體內表達分泌的蛋白質或肽類激素是孤兒

2、GPCRs配基的重要候選成員。為了鑒定這些蛋白質和肽類激素，我們構建了兩個主要的GPCR受體庫，并將50個克隆的人源的孤兒GPCRs在哺乳動物細胞中進行過表達。在其中的一個受體庫中，我們將孤兒GPCRs克隆到pcDNA6載體中，然后讓這些未帶有標簽的孤兒GPCRs在哺乳動物細胞（如HEK293T細胞）中過表達。通過在細胞中共表達一個受GPCR下游信號通路調控的NanoLuc報告基因元件，這些蛋白質和多肽能夠通過敏感的報告基因分析來進行篩

3、選。在另一個受體庫中，這些孤兒GPCRs被克隆到pTRE3G載體中，然后這些C末端融合了EGFP標簽的GPCRs在哺乳動物細胞中以一種可控的方式進行過表達。通過使用融合了熒光探針的蛋白質和多肽，GPCRs的配基在熒光顯微鏡下根據(jù)配基誘導的內吞現(xiàn)象來進行篩選。我們構建的GPCR受體庫為尋找可能是潛在藥物靶點的孤兒GPCRs的配基提供了便利和研究基礎。
　　在另一項工作中，我們用Nanoluciferase（NanoLuc）作為一個融

4、合表達標簽提高了白介素-6（IL-6）在大腸桿菌中的可溶性表達，并且最終得到具有很高的生物活力的成熟IL-6。Nanoluciferase（NanoLuc）是Promega公司在2012年研制的迄今最亮的生物發(fā)光報告分子。我們將NanoLuc融合到人白血病抑制因子（LIF）上，既提高了LIF蛋白在大腸桿菌中的表達量又可以進行各種生物發(fā)光定量分析。這暗示著NanoLuc可能是一種新的融合伴侶。為了測試NanoLuc作為融合伴侶對其他具有聚