孤兒G蛋白偶聯(lián)受體庫的構(gòu)建以及人源白介素-6的優(yōu)化表達(dá).pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）是最大的具有重要生物學(xué)功能的膜受體家族。人類基因組編碼大約400個(gè)非嗅覺GPCRs，這些GPCRs被認(rèn)為擁有內(nèi)源性的配基。到目前為止，大約有120個(gè)GPCRs的內(nèi)源性配基依然未被發(fā)現(xiàn)，這些GPCRs被稱為孤兒GPCRs。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)或肽類激素能夠激活大約百分之五十的擁有已知內(nèi)源性配基的GPCRs，這些蛋白質(zhì)或肽類激素是GPCR內(nèi)源配基的最重要的組成部分。因此，我們推斷人體內(nèi)表達(dá)分泌的蛋白質(zhì)或肽類激素是孤兒

2、GPCRs配基的重要候選成員。為了鑒定這些蛋白質(zhì)和肽類激素，我們構(gòu)建了兩個(gè)主要的GPCR受體庫，并將50個(gè)克隆的人源的孤兒GPCRs在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行過表達(dá)。在其中的一個(gè)受體庫中，我們將孤兒GPCRs克隆到pcDNA6載體中，然后讓這些未帶有標(biāo)簽的孤兒GPCRs在哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如HEK293T細(xì)胞）中過表達(dá)。通過在細(xì)胞中共表達(dá)一個(gè)受GPCR下游信號(hào)通路調(diào)控的NanoLuc報(bào)告基因元件，這些蛋白質(zhì)和多肽能夠通過敏感的報(bào)告基因分析來進(jìn)行篩

3、選。在另一個(gè)受體庫中，這些孤兒GPCRs被克隆到pTRE3G載體中，然后這些C末端融合了EGFP標(biāo)簽的GPCRs在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以一種可控的方式進(jìn)行過表達(dá)。通過使用融合了熒光探針的蛋白質(zhì)和多肽，GPCRs的配基在熒光顯微鏡下根據(jù)配基誘導(dǎo)的內(nèi)吞現(xiàn)象來進(jìn)行篩選。我們構(gòu)建的GPCR受體庫為尋找可能是潛在藥物靶點(diǎn)的孤兒GPCRs的配基提供了便利和研究基礎(chǔ)。
　　在另一項(xiàng)工作中，我們用Nanoluciferase（NanoLuc）作為一個(gè)融

4、合表達(dá)標(biāo)簽提高了白介素-6（IL-6）在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，并且最終得到具有很高的生物活力的成熟IL-6。Nanoluciferase（NanoLuc）是Promega公司在2012年研制的迄今最亮的生物發(fā)光報(bào)告分子。我們將NanoLuc融合到人白血病抑制因子（LIF）上，既提高了LIF蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量又可以進(jìn)行各種生物發(fā)光定量分析。這暗示著NanoLuc可能是一種新的融合伴侶。為了測(cè)試NanoLuc作為融合伴侶對(duì)其他具有聚