B族G蛋白偶聯(lián)受體PAC1四環(huán)素誘導可控表達系統(tǒng)的構建及應用.pdf

1、目的:PAC1是神經肽垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)的特異性受體,屬于B族G蛋白偶聯(lián)受體,介導PACAP的神經遞質、神經調質、神經保護及調控神經再生等生物學功能,其生理性及病理學高表達與其所介導的保護細胞、抗細胞氧化損傷及抗細胞凋亡作用密切相關。Tet-on表達調控系統(tǒng)是目前最理想應用最廣泛的真核生物基因表達調控系統(tǒng),能夠高效、

2、嚴格地調控目的基因的表達。為了深入了解 PAC1的功能,構建PAC1可調控表達的細胞系,本課題通過優(yōu)化的Tet-on真核表達調控系統(tǒng)實現PAC1在中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細胞的強力霉素(doxycycline,Dox)依賴的可控表達,初步探討PAC1的表達水平與其所介導的細胞增殖活性和抗凋亡活性之間的關系。
　　方法:通過對實驗室保存的質粒pEYFP-PAC1-EYFP進行雙酶切得到編碼P

3、AC1和增強型黃色熒光蛋白(EYFP,enhancedyellow fluorescent protein)的融和基因PAC1-EYFP,將融和基因PAC1-EYFP克隆到四環(huán)素反應元件pTRE-Tight載體上,獲得重組表達載體pTRE-PAC1-EYFP;基因測序鑒定正確后將改進后新型的四環(huán)素調節(jié)元件載體pTet-on advanced和反應元件載體pTRE-PAC1-EYFP依次轉入CHO細胞中;遺傳霉素G418和潮霉素(Hygr

4、omycin)依次篩選含有兩個元件的陽性克隆PAC1-Tet-CHO,使用梯度濃度四環(huán)素衍生物強力霉素Dox誘導PAC1-EYFP表達,48 h后熒光觀察及Westernblot檢測PAC1表達水平,并通過檢測不同表達水平PAC1-EYFP的細胞增殖活性和抗缺血清誘導凋亡活性及相關指標,包括胞內第二信使cAMP基礎水平,抗凋亡蛋白Bcl-2(B cell lymphoma/leukemia-2)的表達水平與凋亡蛋白Caspase-3的活

5、性等,嘗試揭示PAC1不同表達水平與其所介導的細胞增殖活性和抗凋亡活性之間的關系。
　　結果:本研究利用Tet-on表達調控系統(tǒng),成功地構建了重組表達載體pTRE-PAC1-EYFP,并成功篩選出抗G418和抗潮霉素的細胞系PAC1-Tet-CHO。熒光檢測和Westernblot結果顯示,PAC1-Tet-CHO細胞系可實現Dox依賴的PAC1-EYFP可控表達、并且具有良好誘導性及傳代穩(wěn)定性。PAC1-Tet-CHO細胞系在傳

6、10代后仍能穩(wěn)定地可控表達PAC1-EYFP。流式細胞術,ELISA以及MTT法檢測不同表達水平PAC1-EYFP細胞的增殖活性和抗缺血清誘導凋亡活性及相關指標的結果均顯示:在正常培養(yǎng)條件下,PAC1-EYFP表達水平越高,細胞增殖活性越強,具有較高的胞內cAMP水平;而在缺血清培養(yǎng)條件下,即沒有PAC1配體激活的情況下,PAC1-EYFP表達水平高的細胞具有較高的抗凋亡活性、較高的細胞殘留活性以及較高的抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平和

7、較低的凋亡蛋白Caspase-3的活性;顯示了PAC1可賦予CHO細胞其表達水平依賴的增殖活性和抗缺血清誘導凋亡活性,并且PAC1可能具有非配體依賴激活的抗凋亡固有活性。
　　結論:本研究通過Tet-on表達調控系統(tǒng)成功構建了Dox依賴的PAC1可控表達系統(tǒng),發(fā)現PAC1具有賦予細胞其表達水平依賴的細胞增殖活性和抗缺血清誘導凋亡的活性,并顯示PAC1具有非配體依賴激活的固有活性。研究結果不僅助于闡明過表達PAC1的生理學與病理學的