熱激與四環(huán)素雙重誘導(dǎo)調(diào)控的植物基因表達(dá)系統(tǒng)研究.pdf

1、在植物轉(zhuǎn)基因研究中，建立或獲得一種嚴(yán)緊、高效、靈敏、特異及可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，不僅在對目的基因進(jìn)行精確和經(jīng)濟(jì)地調(diào)控方面具有重要利用價值，而且便于研究目的基因在特定發(fā)育時期和發(fā)育部位的功能，因此，一直倍受國內(nèi)外學(xué)者的重視。目前，可應(yīng)用的植物調(diào)控系統(tǒng)很多，如溫度誘導(dǎo)、植物激素誘導(dǎo)(如ABA、IAA、Auxin)、光誘導(dǎo)、脅迫誘導(dǎo)、金屬鹽離子誘導(dǎo)等。但是，現(xiàn)有的這些誘導(dǎo)系統(tǒng)都存在誘導(dǎo)多元性這一致命的弱點?，F(xiàn)在應(yīng)用最為廣泛的是四環(huán)素調(diào)

2、控系統(tǒng)，主要有tet-off系統(tǒng)(tTA，tetracycline transcriptionalactivator)和tet-on系統(tǒng)(rtTA，Reveres tetracycline transcriptional activator)兩類。但是目前所建立的這兩種系統(tǒng)都存在一定的缺陷，如在系統(tǒng)關(guān)閉時仍有較高水平的泄漏表達(dá)、構(gòu)建的雜合啟動子啟動效率不高、較高濃度的四環(huán)素(tet)對細(xì)胞或植株具有一定的毒害，同時與tTA系統(tǒng)相比，rt

3、TA系統(tǒng)即使是在非誘導(dǎo)狀態(tài)，rtTA與tetO仍有一定的親和力，仍可誘導(dǎo)基因表達(dá)，導(dǎo)致目的基因的基礎(chǔ)表達(dá)水平很高。鑒于此，本文采用tTA系統(tǒng)工作原理，構(gòu)建了一新型熱激與四環(huán)素雙重誘導(dǎo)的tTA系統(tǒng)，以期能在較大程度上使對目的基因的表達(dá)調(diào)控更加嚴(yán)緊、高效、靈敏且具有廣普性。主要研究結(jié)果如下： 1．將含有4個四環(huán)素操縱子元件TetO的序列與花椰菜花葉病毒CaMV35S微啟動子(-46bp mini 35S promoter)片段連接，

4、構(gòu)建成含四環(huán)素操縱元件的人工啟動子Om35S片段，將其克隆入載體pSAU2006中獲得與GUS基因編碼區(qū)以及Tons終止子融合的中間載體pU—Om35Sgus；通過限制性酶切下“Om35S-Gus”片段并將其插入植物表達(dá)載體pVCT2020中，獲得含“Om35S-GUS-Tnos”表達(dá)盒的植物表達(dá)載體pC-Om35Sgus；采用凍融法將該表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草葉片細(xì)胞，以組織化學(xué)法分析GUS基因的瞬間

5、表達(dá)活性。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)Om35S-GUS基因的煙草葉片材料中，在不加四環(huán)素及正常組培條件處理下沒有檢測到GUS活性，表明Om35S人工雜合啟動子為具有表達(dá)嚴(yán)緊性。 2．將N端缺失而自＃157、＃238、＃273和＃404位氨基酸殘基開始保留的擬南芥熱激因子AtHSFlα的C端的編碼基因序列，分別與四環(huán)素阻遏蛋白基因tetR相拼接，獲得融合基因RHSFC157、RHSFC238、RHSFC273、RHSFC404并克隆入載體pSA

6、U2006中，分別構(gòu)建了由35S啟動子控制融合基因的四種中間載體p35S-RHSFC157、p35S-RHSFC238、p35S-RHSFC273、p35S-RHSFC404；通過限制性酶分別酶切四種載體獲得“35S-RHSFC157-Tnos”、“35S-RHSFC238-Tnos”、“35S-RHSFC273-Tnos”和“35S-RHSFC404-Tnos”四種表達(dá)盒基因片段；另外通過限制性酶酶切pU-Om35Sgus載體獲得“O

7、m35S-Gus”片段，將該片段分別與上述四種表達(dá)盒片段之一共同重組進(jìn)表達(dá)載體pVCT2020中，獲得四種四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)35SC157-Orn35Sgus、35SC238-Om35Sgus、35SC273-Om35Sgus和35SC404-Om35Sgus。采用凍融法將構(gòu)建的四種表達(dá)載體分別導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，并經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草葉片細(xì)胞，以組織化學(xué)法分析GUS基因的瞬間表達(dá)活性。結(jié)果顯示：在35℃且不加四環(huán)素時，均能檢測到

8、較強(qiáng)的GUS基因表達(dá)活性，而在加入1mg/L四環(huán)素處理下GUS基因表達(dá)活性均受到抑制。表明這四種調(diào)控系統(tǒng)均具有功能且嚴(yán)格受四環(huán)素負(fù)調(diào)控。 3．將調(diào)控系統(tǒng)35SC157-Om35Sgus中控制調(diào)節(jié)組分的35S啟動子替換成HSP70m人工熱激啟動子，獲得一新型的、由熱激與四環(huán)素雙重誘導(dǎo)調(diào)控的植物基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)70mC157-Om35Sgus。同樣進(jìn)行瞬間表達(dá)分析該系統(tǒng)功能，結(jié)果顯示：(1)在25℃以下及不加四環(huán)素處理下均沒有檢測到GUS活