C族G蛋白偶聯(lián)受體激活機制的精細研究.pdf

1、C族G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs Family C）(以下簡稱C族受體)包括mGluRs、GABABR、CaSR、TasterR等成員，在體內廣泛分布并具有重要的生理功能，其活性受到精密的調控，并與多種疾病的病理進程密切相關。除了GPCR所共有的參與G蛋白偶聯(lián)的HD以及膜內的C末端，C族受體還具有膜外巨大的參與配體結合的VFT，以及連接HD與VFT之間的CRD。同時，相對于其他亞家族受配體誘導的不穩(wěn)定的二聚化，C族受體在體內形成組成性的二

2、聚體。
　　 可以想見，結構復雜的C族C族受體具有復雜的激活機制。在大量的研究基礎上，簡化的基于單體的兩步激活模型得到了廣泛的承認。配體結合到VFT后導致VFT 關閉，進而將激活信號傳導到HD，構象發(fā)生改變后的HD與G蛋白偶聯(lián)從而激活受體。
　　 但是，對于這一激活過程中的精細機制，還尚不了解。比如VFT是如何將構象變化傳導到HD，CRD在其中所扮演的角色，目前還幾乎是空白。而更重要的是，C族受體在體內是組成性的二聚體，

3、對于二聚體在激活過程中復雜的構象變化以及由之而產生的各功能域間的相互作用和拓撲學效應，簡化的兩步激活模型并不能夠完全解釋。另一方面，功能的重要性和結構上的易操控性，使得C族GPCR成為重要的藥物靶點。因此，對于C族GPCR激活機制的精細研究，在理論和應用上都具有重要的意義。
　　 本文研究了異源二聚體GABABR激活過程中的精細機制。我們根據生物信息學研究推測LB1-LB1結合界面對于受體的結構形成，以及GABABR的VFT-V

4、FT相互作用具有重要的意義。由此我們根據構建的三維模型在可能的LB1-LB1結合界面上引入了一系列糖基化位點，進而檢測了突變體的功能變化。結果發(fā)現，GB2-N114和GB2-N141失活，并喪失了所有二聚化的生理效應；而在同樣位點引入的非糖基化突變GB2-Q114和GB2-Q141則無相應改變。這說明引入的糖基化位點所產生的VFT-VFT間的結構阻礙，導致GB1和GB2不能正常二聚化。類似的結果也在GB1中發(fā)現，位于LB1-LB1結合界

5、面的GB1-N229和GB1-N251突變具有類似的生理現象。因此，這些結果探明了GABABR中VFT-VFT相互作用的精細位點，并對GABABR異源二聚化的形成機制提供了新的證據。我們還將糖基化突變引入到GB2的LB2底部，結果發(fā)現GB2-N209喪失了活性，但突變體并不影響異源二聚化，據此推測，該位點的失活與糖基化引入的結構阻礙影響了VFT的構象變化以及與HD的偶聯(lián)有關。
　　 本文在前面工作的基礎上，進一步在CRD中突變了

6、其中嚴格保守的9個Cys殘基。
　　 結果發(fā)現，所有的突變體均可以正常上膜、二聚化、結合配體，但其藥物反應性質均發(fā)生改變，其中mGluR2-C500A產生高組成性活性，mGluR2-C518A激活強度降低，而其余的突變體則完全失活。同時還發(fā)現，上述突變體均可以被PAM所激活。這些結果證明了CRD參與了VFT-HD之間的偶聯(lián)。利用其他手段我們證實了mGluR2-C500A具有完整的活性，并且其組成性活性依賴于CRD間的二硫鍵的存在

7、，由此推測，其組成性活性可能與VFT和CRD之間的相對位置發(fā)生改變有關。為了證實這一點，我們進一步在CRD中進行了雙突變體的研究，結果功能實驗表明，與預測的一致，mGluR2-C500AC519A恢復了配體誘導的激活性質；而生物化學研究表明，VFT的C234具有與CRD中的C500、C518、C519間形成二硫鍵的潛力，從而形成不同的構象并呈現不同的生理效應。類似的結果在mGluiR4和mGluR5中也得到了驗證。
　　 這些結

8、果對我們解析CRD的空間結構，以及理解CRD在二聚體激活過程中所發(fā)生的構象變化，具有重要的意義。
　　 本文還利用生物信息學的方法研究了C族受體的進化路徑。C族受體的VFT與一些細菌中轉運小分子的PBPs具有共同的起源,但不同于PBPs，不同受體的VFT的配體結合具有高度的專一性。本文運用一種擴展的系統(tǒng)進化分析法，通過比較C族受體中的五種典型成員的VFT，來研究配體結合的專一性，這種基因/結構復制引起的功能上的趨異變化，是否是由