NEDL1基因敲除小鼠模型的建立以及表現(xiàn)型分析.pdf

1、研究目的:
　　泛素蛋白連接酶在各種重要的生理病理過(guò)程中都發(fā)揮著重要的作用，NEDL1（NEDD4-like ubiquitin protein ligase-1）作為一種泛素蛋白連接酶目前相關(guān)的研究還很不充足。已有的研究發(fā)現(xiàn)它特異性表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)，它還可以通過(guò)其下游靶點(diǎn)對(duì)細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生以及目標(biāo)蛋白的泛素化降解產(chǎn)生影響。這些研究多為體外實(shí)驗(yàn)，因此我們將建立NEDL1基因敲除小鼠（NEDL1-/-）模型，并且對(duì)其表現(xiàn)型進(jìn)行在體研

2、究，為發(fā)現(xiàn)NEDL1的功能以及可能的作用機(jī)制提供依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.使用Cre/LoxP系統(tǒng)建立NEDL1-/-模型，之后通過(guò)PCR技術(shù)以及western blot技術(shù)驗(yàn)證目標(biāo)基因片段是否被成功敲除并且是否伴隨蛋白表達(dá)量的降低。
　　2.通過(guò)免疫熒光染色以及免疫組化等方法，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察NEDL1對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)各種細(xì)胞發(fā)育的影響。
　　3.通過(guò)Barnes迷宮、三箱實(shí)驗(yàn)、高架十字以及sel

3、f-grooming等實(shí)驗(yàn)，觀察不同基因型小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)差異（包括學(xué)習(xí)能力、社會(huì)交往能力、焦慮行為、重復(fù)刻板行為等）。
　　4.通過(guò)膜片鉗對(duì)不同基因型小鼠的腦片進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long term potentiation，LTP)、微小興奮性突觸后電流(miniature excitatory postsynaptic current，mEPSCs)以及微小抑制性突出后電流(miniaure inhibitory postsyn

4、aptic current，mIPSCs)等指標(biāo)的檢測(cè)，觀察NEDL1敲除后對(duì)小鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞興奮性以及突觸可塑性的影響。
　　5.通過(guò)LC-MS/MS方法對(duì)小鼠血液樣本進(jìn)行氨基酸肉堿代謝譜的檢測(cè)，觀察NEDL1基因和上述代謝產(chǎn)物之間的關(guān)系，以便對(duì)NEDL1作用于何種代謝產(chǎn)物以及通過(guò)什么作用機(jī)制發(fā)揮作用進(jìn)行研究。
　　6.通過(guò)高通量RNA測(cè)序的方法對(duì)小鼠腦組織樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究，觀察NEDL1基因可能的作用靶點(diǎn)以及可以通

5、過(guò)什么樣的機(jī)制發(fā)揮作用。
　　研究結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建NEDL1-/-小鼠，靶基因片段成功敲除并且伴隨目標(biāo)蛋白表達(dá)量的降低。
　　2.NEDL1-/-小鼠和野生型（NEDL1+/+）小鼠相比，其成年之前的膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加。
　　3.在行為學(xué)方面，NEDL1-/-小鼠與NEDL1+/+小鼠相比具有明顯的刻板行為。
　　4.在電生理學(xué)特點(diǎn)方面，NEDL1-/-小鼠和NEDL1+/+小鼠相比，mEPSC、

6、mIPSC以及LTP等指標(biāo)沒(méi)有顯著差異。
　　5.在氨基酸肉堿代謝譜方面，NEDL1-/-小鼠和NEDL1+/+小鼠相比具有明顯的代謝譜差異，相關(guān)的差異功能主要是氨基酸代謝、利用以及蛋白質(zhì)合成等。
　　6.在轉(zhuǎn)錄組方面，NEDL1-/-小鼠和NEDL1+/+小鼠相比具有明顯的差異，主要的差異功能為腫瘤形成、神經(jīng)系統(tǒng)興奮性以及腦發(fā)育等。
　　研究結(jié)論:
　　我們成功構(gòu)建了NEDL1-/-小鼠，它具有在成年之前膠質(zhì)細(xì)