遺傳包涵體肌病的病理機制研究及基因突變型-表現(xiàn)型分析.pdf

1、研究目的:1.探討HIBM的病理發(fā)生機制.通過電鏡觀察肌核改變,尋找凋亡的形態(tài)學證據(jù).應(yīng)用TUNEL方法驗證有無DNA片段化形成.通過凋亡過程中關(guān)鍵性酶蛋白以及凋亡后期特異蛋白的表達分析,檢測處于不同階段的凋亡肌纖維.2.通過對細胞凋亡不同途徑蛋白信號表達分析,探討HIBM凋亡發(fā)生的可能途徑.3.應(yīng)用自噬體特異性蛋白和其它細胞內(nèi)膜性細胞器特異性蛋白的表達分析,探討鑲邊空泡內(nèi)膜性結(jié)構(gòu)的來源和性質(zhì),以及是否存在自噬性細胞死亡形式.4.對HI

2、BM的臨床表現(xiàn)型和基因突變型進行回顧性分析,探討不同基因突變類型與臨床表現(xiàn)型的關(guān)系.研究方法:1.應(yīng)用HIBM的新鮮肌活檢標本,制作投射電鏡觀察用的樣本,通過大量的樣本切片觀察,對鑲邊空泡纖維肌漿內(nèi)收縮成分、膜結(jié)構(gòu)、包涵體以及肌核的改變進行分析,著重觀察肌核改變,尤其是早期的染色質(zhì)分布和結(jié)構(gòu)變化.2.應(yīng)用原位TUNEL染色方法分析HIBM患者肌纖維的凋亡現(xiàn)象.3.建立標準的大鼠胸腺凋亡動物模型,同時進行電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察和原位TUNEL染

3、色,以此作為TUNEL方法的陽性對照,驗證TUNEL染色的特異性和敏感性.4.應(yīng)用免疫組織化學方法,對HIBM患者肌肉組織中凋亡相關(guān)蛋白的表達情況進行觀察,并與Duchenne型肌營養(yǎng)不良(DMD)、多發(fā)性肌炎(PM)、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)和正常的肌肉組織進行對比分析.5.應(yīng)用免疫組織化學方法,通過對溶酶體、自噬體和吞飲小體標志性蛋白在HIBM肌肉組織中的表達分析,探討溶酶體/自噬體系統(tǒng)在該病病理機制中的作用.6.從冷凍的肌肉標本中

4、抽提HIBM患者DNA,13個外顯子經(jīng)PCR擴增、純化和基因測序,檢測HIBM致病基因GNE的突變形式,同時回顧性分析HIBM患者的臨床和病理表現(xiàn),探討基因突變型和臨床表現(xiàn)型間的關(guān)系.結(jié)論:1.肌核改變、原位TUNEL陽性表達以及凋亡執(zhí)行酶活性caspase-3的上調(diào)均顯示HIBM患者肌纖維存在凋亡現(xiàn)象.Caspase-12和GRP78的陽性表達提示HIBM肌纖維凋亡可能是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路發(fā)生的.2.溶酶體、自噬體、吞飲小泡和其它細胞