抑制K562細(xì)胞中IER3IP1基因表達(dá)對細(xì)胞增殖和紅系分化影響的探討.pdf

1、目的:設(shè)計(jì)構(gòu)建特異性針對IER31P1基因的shRNA真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞株，探討靶向干擾IER31P1基因?qū)562細(xì)胞生物學(xué)行為以及對細(xì)胞紅系分化能力的影響。為進(jìn)一步探討IER31P1基因在K562細(xì)胞中的功能和紅系分化的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法:針對IER31P1基因設(shè)計(jì)合成2對特異性DNA片段以及1對無關(guān)序列的陰性對照DNA片斷，將它們插入真核表達(dá)質(zhì)粒pGenesil-1中構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞株后

2、，以RT-PCR檢測IER31P1基因表達(dá)的抑制效果。選擇抑制效果較好的重組載體用于進(jìn)一步的干擾實(shí)驗(yàn)研究，并將該重組細(xì)胞命名為K562/shRNA-IER31P1。 抑制K562細(xì)胞中IER31P1基因表達(dá)后，采用MTT試驗(yàn)檢測K562/shRNA-IER31P1組細(xì)胞的增殖狀態(tài)、電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期時(shí)相分布以及RT-PCR檢測bcr/abl mRNA表達(dá)的變化。 將未轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞及pGene

3、sil-1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞作為對照組，分別采用0.2μmol/L的伊馬替尼（Imatinib）和30μmol/L的氯高鐵血紅素（Hemin）作用K562/shRNA-IER31P1組48h后，誘導(dǎo)細(xì)胞向紅系分化，采用聯(lián)苯胺染色、流式細(xì)胞儀檢測和RT-PCR試驗(yàn)觀察抑制IER31P1基因表達(dá)后對細(xì)胞聯(lián)苯胺陽性率、細(xì)胞表面的GPA蛋白的表達(dá)以及紅系分化相關(guān)基因Gfi-1B、GPA和γ-globin的mRNA表達(dá)情況的影響。

4、結(jié)果:成功構(gòu)建2個(gè)針對IER31P1的shRNA真核表達(dá)載體。所構(gòu)建的載體中有1對能夠特異性地降低K562細(xì)胞中IER31P1的mRNA表達(dá)水平，與pGenesil-1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照組相比，抑制率可達(dá)76％，干擾效果顯著，抑制率較高。并用該重組細(xì)胞作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究對象，命名為K562/shRNA-IER31P1。 K562/shRNA-IER31P1組與其它對照組相比，MTT結(jié)果顯示細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（P<0.0

5、1）；流式細(xì)胞術(shù)顯示G0/G1期細(xì)胞由（44.04±2.15）％減少到（34.04±1.83）％，S期細(xì)胞由（50.02±2.37）％增高到（61.14±2.20）％，細(xì)胞增殖能力增加（P<0.05）；電鏡可見細(xì)胞常染色質(zhì)增加、異染色質(zhì)減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分?jǐn)U張，囊泡樣結(jié)構(gòu)滯留。RT-PCR試驗(yàn)中與對照組細(xì)胞相比，K562/shRNA-IER31P1組bcr/abl mRNA表達(dá)升高（P<0.05）。 分別用0.2μmol/L的伊馬替

6、尼和30μmol/L的氯高鐵血紅素作用48h后，K562/shRNA-IER31P1組聯(lián)苯胺陽性率降低分別由（44.67±2.52）％降至（22.67±1.53）％，由（23.00±3.61）％降至（11.67±2.08）％（P<0.01），GPA蛋白平均熒光強(qiáng)度MFI表達(dá)分別由（2006.85±40.05.）降低至（1335±31.77），由（1281.87.07±32.22）降低至（912.81±27.92），K562/shRNA-

7、IER31P1組相比對照組MFI值均降低（P<0.05），紅系分化相關(guān)基因Gfi-1B、GPA和γ-globin的mRNA表達(dá)降低（P<0.01）。 結(jié)論:設(shè)計(jì)構(gòu)建的shRNA真核表達(dá)載體可以特異性干擾IER31P1基因的表達(dá)，為進(jìn)一步研究IER31P1基因的功能奠定了基礎(chǔ)。干擾K562細(xì)胞中IER31P1基因表達(dá)后，細(xì)胞增殖加快，bcr/abl mRNA表達(dá)升高，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到影響，提示該基因可能影響K562細(xì)胞中