黃芪誘導(dǎo)K562細(xì)胞紅系分化有效成分初篩及基因表達(dá)譜分析.pdf

1、研究背景： β地中海貧血(β-thalassemia，β-地貧)是由于編碼β珠蛋白基因的點(diǎn)突變或核苷酸序列缺失造成β鏈合成減少或缺如、α/非α鏈不平衡，導(dǎo)致未匹配的α珠蛋白鏈過(guò)剩、沉淀，加速紅細(xì)胞前體細(xì)胞在骨髓中的過(guò)早破壞和凋亡而形成的無(wú)效造血。天然藥物的研究和應(yīng)用使疾病的防治進(jìn)入一個(gè)嶄新的階段，部分方劑能緩解地貧的貧血癥狀，減少輸血量，代償因β-珠蛋白基因缺陷而造成的Hb生成不足，提高Hb。中藥特有的理論體系和治療方法，在治療

2、地貧上積累了豐富的臨床用藥經(jīng)驗(yàn)。 根據(jù)中醫(yī)的“補(bǔ)氣生血”理論，黃芪(Astragalusmembranaceus，AM)為諸多補(bǔ)血或補(bǔ)氣方劑中的重要組成成分，對(duì)造血系統(tǒng)有著廣泛的影響。黃芪味甘，性微溫，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表、利水消腫、托瘡生肌等功效。其成分復(fù)雜，含黃芪多糖(Astragaluspolysaccharide，APS)、黃芪苷(Astragalosides，AST)、黃酮、單糖、生物堿、葉酸、多種氨基酸、維生素、苦

3、味素及鋅、硒、鐵等14種人體所需的微量元素。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示：在2.85-39.9g/kg范圍，用藥安全，無(wú)明顯的毒副作用?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪具有清除自由基、抗缺氧、強(qiáng)心、降壓、改善微循環(huán)、心肌保護(hù)、抑制血小板聚集及免疫調(diào)節(jié)等多方面的藥理作用，而對(duì)紅細(xì)胞增殖分化及誘導(dǎo)γ-珠蛋白表達(dá)的研究報(bào)道不多。本課題組前期研究已證實(shí)單味黃芪具有誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化的作用：可提高聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性細(xì)胞率、增加Gγ-mRNA表達(dá)、提高HbF。是黃芪中的

4、何種成分誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化?可影響哪些珠蛋白的表達(dá)?通過(guò)哪些相關(guān)的基因起作用?這些問(wèn)題尚不清楚。 研究發(fā)現(xiàn)一些基因如LMO2、SCL、Bra、Flk-1、Runx1、GATA-1、GATA-2、EKLF、BKLF、NFE2、EpoR等可調(diào)控紅系分化、珠蛋白基因表達(dá)，它們的表達(dá)水平隨紅系發(fā)育和分化進(jìn)行而改變，在紅系分化早期、紅系祖細(xì)胞增殖、終末分化及珠蛋白轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。既往研究多為單基因或少數(shù)幾個(gè)基因的表達(dá)，

5、各研究間缺少更直接的聯(lián)系，大量的信息都是孤立的。20世紀(jì)90年代誕生的基因芯片技術(shù)，與傳統(tǒng)基因研究方法相比，具有無(wú)可比擬的高信息量、高通量，可以快速、準(zhǔn)確地分析數(shù)以千計(jì)的基因組信息，具有極高的工作效率。可較直觀地反映不同條件和狀態(tài)下的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平，從而為尋找基因調(diào)控機(jī)理提供了一條有效的途徑。對(duì)藥物作用后的差異表達(dá)基因分析，有助于從宏觀上了解藥物作用后細(xì)胞基因表達(dá)譜的改變，在分子層面探索藥物的作用機(jī)制，明確藥物作用靶點(diǎn)。 目的

6、： 提取單味中藥黃芪的不同成分直接作用K562細(xì)胞，篩選出黃芪誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化的有效成分。應(yīng)用黃芪有效成分直接作用K562細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片分析，篩選出差異表達(dá)的珠蛋白基因及與紅系分化相關(guān)的基因，從分子水平了解黃芪的藥物作用靶點(diǎn)及可能的作用機(jī)制，為藥物的臨床應(yīng)用提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為治療地中海貧血的藥物研發(fā)開(kāi)辟新的途徑。 方法： 1、黃芪有效成分篩選 1.1超聲醇提水提法提取黃芪根，用所得提

7、取物濃度為4mg/ml(生藥計(jì))的AST和APS分別作用K562細(xì)胞，于誘導(dǎo)后24、48、72、96h各時(shí)間點(diǎn)行聯(lián)苯胺染色，記錄各組不同時(shí)間點(diǎn)的聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性細(xì)胞率(BZ％)及陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)(NBZ)，觀察K562細(xì)胞向紅系分化的變化。丁酸鈉(sodiumbutyrate，NaB)為陽(yáng)性對(duì)照組，未加處理因素組為陰性對(duì)照組。 1.2APS不同濃度50、100、200、400ug/ml(多糖計(jì))分別誘導(dǎo)K562細(xì)胞，聯(lián)苯胺染色動(dòng)態(tài)檢測(cè)

8、其向紅系分化的誘導(dǎo)作用，測(cè)定藥物的作用濃度及作用時(shí)間。 1.3RT-PCR檢測(cè)APS、NaB作用后Cγ-mRNA表達(dá)。 1.4Western-blot檢測(cè)APS、NaB作用后HbF表達(dá)。 1.5四唑鹽比色法(MTT)測(cè)定APS作用K562細(xì)胞后的細(xì)胞活性，檢測(cè)APS對(duì)細(xì)胞增殖的影響。 2、基因表達(dá)譜分析 2.1應(yīng)用Affymetrix公司的人類全基因組“HG-U133Plus2”芯片，篩選出APS

9、作用K562細(xì)胞后的差異表達(dá)基因。 2.2RT-PCR方法驗(yàn)證α、β、Aγ、Gγ、δ、ε及ζ7個(gè)珠蛋白基因，選擇芯片中表達(dá)、不表達(dá)、上調(diào)及下調(diào)的與紅系分化相關(guān)的基因EKLF、BKLF、LMO2、NFE2、GATA1、GATA2、FKLF、SP1、CP1、NFE4進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。 結(jié)果： 1、黃芪有效成分篩選 1.14mg/mlAPS、4mg/mlAST、0.5mmol/LNaB分別誘導(dǎo)K562細(xì)胞后

10、BZ％峰值分別為13.2％，2.9％，17.5％，各組BZ％比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=285.348，P=0.000)。APS組24、48、72hBZ％低于NaB組，96hBZ％高于NaB組(F=218.082，P=0.000)。AST組24、48、72、96hBZ％均低于NaB組(P=0.000)，與未加處理因素的對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.333)。4mg/mlAPS、4mg/mlAST、0.5mmol/LNaB誘導(dǎo)后NBZ

11、峰值分別為104776.7±4909.3、26675.3±2515.7及80475.3±6065.3，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=468.094，P=0.000)。APS組24、48h的NBZ低于NaB組，72、96h的NBZ高于NaB組(F=228.127，P=0.000)。AST組24、48、72及96h的NBZ與未加處理因素的對(duì)照組比較(P=0.264)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 1.2取濃度為50、100、200、400ug

12、/mlAPS分別誘導(dǎo)K562細(xì)胞，聯(lián)苯胺染色發(fā)現(xiàn)各組均有誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化的作用，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=496.094，P=0.000)。各濃度組中以200ug/ml組的BZ％值最高，誘導(dǎo)后72h達(dá)峰值(14.13±0.65)。 1.3RT-PCR檢測(cè)APS作用K562細(xì)胞后Gγ-mRNA表達(dá)明顯增加，其相對(duì)表達(dá)量為0.4938±0.009，NaB陽(yáng)性對(duì)照組為0.5351±0.010，未加處理因素的對(duì)照組為0.1

13、157±0.012，不同處理組間比較(F=1446.178，P=0.000)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 1.4Western-Blot檢測(cè)APS作用K562細(xì)胞48h的HbF表達(dá)量明顯上調(diào)，其相對(duì)表達(dá)量為0.9322±0.030，NaB陽(yáng)性對(duì)照組為1.0215±0.024，未加處理因素的對(duì)照組為0.2653±0.030。不同處理組間比較(F=641.356，P=0.000)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 1.5MTT法測(cè)定吸光度OD值顯

14、示，組間比較差異有顯著意義(F=176.481，P=0.000)，與對(duì)照組比較，APS、AST對(duì)K562細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響(P=0.276，P=0.106)，而NaB有明顯影響細(xì)胞增殖的作用(P=0.000)。 2、基因表達(dá)譜芯片分析 2.1APS作用K562細(xì)胞后表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因31個(gè)，表達(dá)下調(diào)2倍以上的基因108個(gè)。差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能主要是參與蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞代謝過(guò)程、細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄激活、生物學(xué)調(diào)節(jié)及信

15、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。 2.2APS作用K562細(xì)胞后γ-珠蛋白基因表達(dá)上調(diào)，而α、β、δ、ε及ζ珠蛋白基因無(wú)明顯改變。與紅系分化相關(guān)的基因LMO2、Runx1、GTF2I表達(dá)均上調(diào)；BKLF、EKLF、EPHB4及Sp1的表達(dá)均下調(diào)；而GATA1、GATA2、NF-E2等的表達(dá)無(wú)改變。 2.3RT-PCR檢測(cè)與芯片結(jié)果一致。 結(jié)論： 1、首次證明中藥黃芪誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化的有效成分是APS，可使聯(lián)苯胺染色陽(yáng)

16、性細(xì)胞增加、Gγ-mRNA表達(dá)增加、HbF的表達(dá)增加。 2、APS細(xì)胞增殖無(wú)影響。 3、首次應(yīng)用APS誘導(dǎo)K562細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能主要是參與蛋白質(zhì)結(jié)合，細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)錄激活，生物學(xué)調(diào)節(jié)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。 4、APS作用K562細(xì)胞后可使γ珠蛋白基因表達(dá)上調(diào)，α、β、δ、ε及ζ珠蛋白基因無(wú)明顯改變。 5、APS作用K562細(xì)胞后可使紅系分化相關(guān)的基因LMO2、Runx1、GTF2I