外源性Wnt5a誘導(dǎo)K562細(xì)胞定向分化的研究.pdf

1、目的： Wnt家族成員之一Wnt5a與其它家族成員一樣，在個(gè)體發(fā)育中必不可少，近來研究發(fā)現(xiàn)它與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，但確切關(guān)系和作用機(jī)制不明，特別是它與白血病發(fā)生的關(guān)系和作用罕見報(bào)道。本研究觀察了Wnt5a在髓細(xì)胞白血病病例和白血病細(xì)胞株中的表達(dá)情況，提示W(wǎng)nt5a表達(dá)缺失可能與白血病發(fā)生有關(guān)。進(jìn)而以外源性Wnt5a處理髓系白血病細(xì)胞株K562，觀察其誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化的作用。該研究為深入認(rèn)識(shí)Wnt5a在白血病發(fā)生中的作用和機(jī)制打

2、下了基礎(chǔ)，并希望為白血病診斷提供新的腫瘤標(biāo)志物和基因治療靶點(diǎn)。 方法： 1.應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)6例慢性髓細(xì)胞白血病患者和5例急性髓細(xì)胞白血病患者的骨髓或外周血標(biāo)本，以及Jurkat、K562、HL-60等白血病細(xì)胞株中Wnt5a的表達(dá)。 2.應(yīng)用HEK293細(xì)胞擴(kuò)增帶有標(biāo)記基因GFP的重組腺病毒AdWnt5a和對(duì)照AdGFP，并制備條件培養(yǎng)液：以AdWnt5a和AdGFP分別感染CHO細(xì)胞，16h后熒光顯微

3、鏡下檢測(cè)GFP表達(dá)，更換為低血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，于48h后收集培養(yǎng)上清液，冷凍、干燥濃縮后，WesternBlot鑒定Wnt5a蛋白的表達(dá)。 3.分別以Wnt5a和GFP條件培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)K562細(xì)胞1～5d，并以臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)和總細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制生長曲線并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 4.流式細(xì)胞儀分析Wnt5a條件培養(yǎng)液處理K562細(xì)胞1、3、5d時(shí)細(xì)胞周期的變化情況，并與對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行比較。 5.將Wnt5a、

4、GFP條件培養(yǎng)液分別處理1～5d的K562細(xì)胞進(jìn)行瑞姬氏染色，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變，并在透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。 6.將Wnt5a和GFP條件培養(yǎng)液分別處理1～7d的K562細(xì)胞涂片固定，進(jìn)行過氧化物酶(POX)、糖原(PAS)、α-醋酸萘酚(α-NAE)+氟化鈉抑制試驗(yàn)的細(xì)胞化學(xué)染色，光鏡下觀察細(xì)胞陽性率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 7.將Wnt5a和GFP條件培養(yǎng)液分別處理1～7d的K562細(xì)胞涂片固定，利用免疫

5、細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)單核細(xì)胞表面分化抗原CD13、CD68的表達(dá)，和粒細(xì)胞表面分化抗原CD14的表達(dá)，計(jì)算陽性率并遄行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 1.6例慢性髓細(xì)胞白血病病例均未表達(dá)Wnt5a，5例急性髓細(xì)胞白血病病例其中4例不表達(dá)或弱表達(dá)，僅1例高表達(dá)經(jīng)查為完全緩解的病例。在K562、HL-60髓系白血病細(xì)胞株中Wnt5a也不表達(dá)，而Jurkat細(xì)胞有高表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，故以Jurkat作為實(shí)驗(yàn)中的陽性對(duì)照。 2.

6、用HEK293細(xì)胞擴(kuò)增得到高滴度的重組腺病毒AdWnt5a和AdGFP上清液。分別以AdWnt5a和AdGFP上清感染CHO細(xì)胞，以制備Wnt5a和GFP條件培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下觀察到二者有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，且Wnt5a條件培養(yǎng)液經(jīng)WesternBlot檢測(cè)出了Wnt5a蛋白的表達(dá)。 3.Wnt5a處理組、GFP對(duì)照組及未處理組的K562細(xì)胞，生長曲線顯示，Wnt5a明顯抑制K562細(xì)胞的增殖，但臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示未影響到細(xì)胞的存

7、活率。 4.Wnt5a條件培養(yǎng)液處理5d的K562細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞比較，細(xì)胞周期的G2期增高了3.22倍，表明Wnt5a將細(xì)胞周期阻止在G2期。 5.光鏡下與對(duì)照相比，經(jīng)Wnt5a條件培養(yǎng)液處理的K562細(xì)胞：細(xì)胞體積縮小，核漿比減小，核染色質(zhì)濃縮，核仁減少或消失，有的核出現(xiàn)了凹陷，并且出現(xiàn)了個(gè)別具有典型單核細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞。超微結(jié)構(gòu)的變化：細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)增多，核仁減少或變小，胞質(zhì)增多，核漿比減小，細(xì)胞器明顯增多。

8、 6.Wnt5a處理后，K562細(xì)胞POX、PAS細(xì)胞化學(xué)染色的陽性率均明顯提高，且與對(duì)照組相比差異顯著。α-NAE染色呈強(qiáng)陽性，并且70％以上的陽性率可被氟化鈉所抑制。 7.Wnt5a處理組的K562細(xì)胞，其單核細(xì)胞系表面分化抗原CD14、CD68陽性率明顯高于GFP對(duì)照組，二者差異顯著；粒細(xì)胞系表面分化抗原CD13表達(dá)也增強(qiáng)，但與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1.RT-PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Wnt5a在9

9、0％的急、慢性髓細(xì)胞白血病和髓系白血病細(xì)胞株：K562、HL-60中均表達(dá)缺失，而在1例完全緩解的病例中有表達(dá)，提示W(wǎng)nt5a表達(dá)缺失可能與白血病的發(fā)生有關(guān)。 2.Wnt5a條件培養(yǎng)液處理的K562細(xì)胞，與對(duì)照組相比：細(xì)胞生長明顯受到抑制，細(xì)胞周期G2期明顯增高，提示W(wǎng)nt5a可能將K562細(xì)胞周期阻滯在G2期，使細(xì)胞不能進(jìn)行正常的有絲分裂，從而抑制了細(xì)胞的增殖。 3.Wnt5a條件培養(yǎng)液處理后細(xì)胞形態(tài)上出現(xiàn)了分化的表型

10、，并觀察到了個(gè)別典型的單核細(xì)胞形態(tài)，超微結(jié)構(gòu)也顯示有成熟的趨勢(shì)。POX、PAS、α-醋酸萘酚(α-NAE)+氟化鈉抑制的細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果表明，Wnt5a處理的K562細(xì)胞有向粒-單系統(tǒng)分化的現(xiàn)象。檢測(cè)單核細(xì)胞系表面標(biāo)志抗原CD14、CD68的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果，則進(jìn)一步證實(shí)了外源性的Wnt5a可誘導(dǎo)K562細(xì)胞向單核細(xì)胞系分化的趨勢(shì)。 以上研究提示，Wnt5a表達(dá)缺失可能是髓細(xì)胞白血病發(fā)生的原因之一，Wnt5a可能在其中起到了