T-2毒素影響K562細胞向紅系細胞分化的分子機理研究.pdf

1、T-2毒素是由鐮刀菌產生的毒性最強的A族單端孢霉烯族毒素，是全球糧谷類最常見的污染性霉菌毒素。動物或人食入被該毒素污染的食物會導致食物中毒性白細胞缺乏癥、單端孢霉烯族中毒癥、大骨節(jié)病、人畜赤霉糧中毒癥和克山病等多種疾病。臨床上，中毒癥狀主要表現為拒食、腹瀉、嘔吐、貧血、免疫力下降、內臟器官的出血、骨髓組織的壞死、母畜不孕或流產甚至死亡。
　　造血系統是T-2毒素的主要靶器官之一，它對造血系統的損傷作用以及對外周血樣的毒性作用大于同

2、類毒素。毒素進入機體后引起造血器官損傷，導致骨髓組織壞死，影響多能干細胞的功能，使多種血液成分的數量比例失衡，表現為:骨髓和脾臟紅髓細胞損傷、骨髓發(fā)育不全、血液系統內造血細胞數目顯著減少、紅細胞計數和容積下降、貧血以及紅細胞溶血等癥狀。正常動物體內的紅細胞是由多能干細胞向紅系細胞分化而來的，因此，為了闡釋T-2毒素引起造血系統損傷的作用機理，研究T-2毒素影響造血干細胞分化的分子作用機理是非常必要的。然而，前人對多能干細胞向紅系細胞的分

3、化進行研究，僅得到了參與分化過程的部分基因家族和信號通路，并未對紅系分化的分子機理進行系統研究，且毒素影響多能干細胞向紅系細胞分化過程的分子機理目前鮮有研究。
　　本實驗室前期以處于多能干細胞階段的K562細胞為模型，發(fā)現T-2毒素可抑制K562細胞的紅系分化過程，并用基因芯片和二維電泳技術對基因和蛋白的表達水平進行檢測，得到了981個差異表達基因和22個差異表達蛋白。本課題在本實驗室前期研究結果的基礎上對差異表達基因和蛋白進行篩

4、選，得到了可能參與紅系分化的8個差異表達基因和4個差異表達蛋白，運用實時熒光定量PCR、Western bolt、RNAi和流式細胞術，對T-2毒素作用下基因的mRNA表達水平和蛋白表達水平以及細胞分化水平進行檢測，探討T-2毒素抑制K562細胞向紅系細胞分化的分子作用機理，為揭示單端孢霉烯族毒素的血液系統毒性作用機制提供理論依據。
　　本課題首先在實驗室前期研究的基礎上，篩選T-2毒素作用下表達水平變化較大(Folds≥2)的基

5、因和蛋白，在此篩選結果的基礎上選擇陰性對照組(0.6 mM丁酸鈉)中表達水平變化趨勢與T-2毒素處理組相反，且在陽性對照組(1 mM H2O2)中表達水平變化趨勢與T-2毒素處理組相同的基因和蛋白。對基因芯片的結果進行分析篩選，得到了8個可能參與T-2毒素抑制紅系分化過程的基因，分別是:PI3K、MS4A3、EPAS1、ZNF382、SQSTM1、INSIG1、KDM4D和GPSM2。對二維電泳的結果分析后得到了HSP27、PRDX3、

6、PSMC2和ACTR1A等4個可能與紅系分化有關的差異表達蛋白。
　　為研究T-2毒素抑制多能干細胞向紅系分化的調控途徑，本實驗分別設置空白對照組、T-2毒素處理組和T-2毒素與信號通路抑制劑共處理組，不同化合物分別與細胞共孵育24 h和48 h后，用CD235a-FITC抗體與紅細胞表面特異性抗原CD235a結合，然后用流式細胞儀檢測CD235a的表達量，從而判斷細胞的紅系分化率。通過比較不同處理組中CD235a表達量的變化，發(fā)

7、現JAK2-STAT3信號通路促進紅系分化，而NF-κB信號通路則抑制紅系分化過程，且T-2毒素可通過JAK2-STAT3、p38、ERK、JNK和NF-KB信號通路調控K562細胞向紅系分化的過程。
　　為檢測T-2毒素與篩選所得基因和蛋白間的關系，用15 nM T-2毒素分別處理細胞2h、6h、12h、24 h和48 h后，提取細胞總RNA，檢測各基因的mRNA表達水平與T-2毒素間的時效關系。在基因表達水平變化最顯著的時間點

8、用信號通路抑制劑分別預處理細胞后，再加入T-2毒素，結果表明，T-2毒素可通過JAK2正調控HSP27、PSMC2、SQSTM1和ZNF382基因的表達水平，且負調控ACTR1A基因的表達水平;通過STAT3抑制PI3K、ACTR1A、INSIG1和PRDX3基因的表達，而對HSP27、SQSTM1、EPAS1和KDM4D基因的表達起促進作用;通過p38信號通路對INSIG1和PRDX3基因的表達水平進行負調控，但可促進HSP27基因的

9、表達水平;也可通過JNK正調控SQSTM1和ZNF382基因的表達水平，負調控ACTR1A基因的表達水平;亦可通過ERK信號通路促進SQSTM1、EPAS1和ZNF382基因的表達;還可通過NF-κB信號通路使KDM4D、SQSTM1和ZNF382基因的表達水平顯著上調，且抑制ACTR1A基因的表達。
　　隨后，運用RNA干擾技術使目的基因表達沉默，對MS4A3基因在紅系分化中的作用進行了深入研究。用脂質體(Lipofectami

10、neTM2000)轉染自身帶有熒光信號的siRNA，顯微鏡下觀察發(fā)射熒光信號的細胞，通過計算發(fā)射熒光信號的細胞占總細胞數的比例，計算轉染效率。當加入siRNA的劑量為30 ng時轉染效率在70％以上，且細胞生長狀態(tài)良好，符合實驗要求，即K562細胞適合用脂質體轉染siRNA的方法使基因表達沉默。用多項研究已證明了的對任何基因表達水平無顯著影響的siRNA作為陰性對照，用看家基因GAPDH的特異性siRNA作為陽性對照，檢測發(fā)現30 ng

11、時GAPDH的表達水平極顯著下調，這說明該方法可行，且GAPDH可作為RNA干擾實驗的陽性對照。本課題還設計了兩條特異性使目的基因MS4A3表達沉默的siRNA序列(s2609和s2610)，經檢測s2609比s2610穩(wěn)定性強，且符合實驗要求。MS4A3的表達被沉默后，K562細胞的紅系分化率下調極顯著，表明MS4A3在紅系分化中起促進作用;檢測篩選所得的其他基因和蛋白質的表達水平，發(fā)現與干擾前相比，GATA-1和HSP27基因的表達

12、水平上調極顯著，ZNF382和SQSTM1基因的表達水平極顯著下調，這表明這些基因位于MS4A3的下游，且MS4A3基因正調控ZNF382和SQSTM1基因的表達，而對GATA-1和HSP27基因的表達起負調控作用;對HSP27的基因和蛋白水平檢測發(fā)現T-2毒素可通過MS4A3基因對HSP27-GATA-1的表達水平起抑制作用，從而抑制K562細胞的紅系分化過程。
　　綜上所述，本課題首先對本實驗室的前期研究結果進行了分析篩選，得

13、到了可能參與T-2毒素影響造血干細胞向紅系細胞分化過程的8個差異表達基因和4個差異表達蛋白;通過對T-2毒素與信號通路的關系、信號通路與基因（蛋白）的關系和T-2毒素與基因（蛋白）的調控關系進行了研究，找到了T-2毒素調控紅系分化的重要信號通路，以及這些信號通路對篩選所得基因（蛋白）的調控作用;首次對MS4A3基因在紅系分化過程中的作用進行研究，得到了MS4A3基因與其他紅系分化相關基因間的調控關系，確定了該基因在紅系分化過程中的重要作