RNAi抑制bcr-abl融合基因表達及其對K562細胞的影響.pdf

1、慢性粒細胞白血病(CML)是起源于多能造血干細胞的惡性克隆增殖性疾病。95％的CML具有曲染色體，該染色體是由于9，22號染色體易位導致的t(9；22)(q34；q11)。22號染色體bcr基因的N端與9號染色體abl基因的C端(外顯子2-11)聯(lián)結(jié)在一起形成bcr/abl融合基因，編碼210KD的癌蛋白。與內(nèi)源性的abl(p120)相比，ber/abl(p210)具有持續(xù)的酪氨酸激酶活性。體外細胞株及動物實驗結(jié)果表明，p210對于CM

2、L的發(fā)病是必需的。P210使細胞增殖增加，凋亡受阻和粘附缺陷。因此，bcr/abl融合蛋白在揭示CML的分子病理機制及治療中有重要意義，并為臨床治療提供了新的靶點。 新興的RNA干擾技術(shù)是一種由雙鏈RNA誘導的基因沉默現(xiàn)象，它可以降解特定的mRNA，使之無法翻譯成蛋白質(zhì)，從而抑制特定基因的表達。Elbashir等證實在細胞內(nèi)誘導RNAi作用的實際上是一些21．23個核苷酸的短小雙鏈RNA(smallinterferingRNAs

3、，siRNAs)，并且在體外轉(zhuǎn)入哺乳動物細胞后，同樣可以使特定基因的表達受到有效抑制。該方法是一種高效的、特異的研究基因功能的技術(shù)，并有可能成為一種有效的基因治療手段。本研究應用特異的針對bcr／ablmRNA的siRNA，在mRNA水平阻斷bcr/abl的表達，觀察阻斷融合基因表達后腫瘤細胞生長和增殖的改變，并研究對融合基因部分相關(guān)下游轉(zhuǎn)導信號的影響，進一步探討ber/abl融合基因在慢性粒細胞白血病形成中的作用和可能的分子機制，為臨

4、床提供一種可能的靶向治療手段。本研究分為以下四個部分： 第一部分實時定量RT-PCR檢測bcr／abl融合基因的方法建立及臨床應用穩(wěn)定建立了以TaqManTM技術(shù)原理為基礎(chǔ)的實時定量RT-PCR技術(shù)檢測慢性粒細胞白血病ber／ablmRNA的方法，探討CMLbcr／abl融合基因的表達水平與臨床療效的關(guān)系。該方法可同時檢測b2a2和b3a2兩種亞型，GAPDH的mRNA作為內(nèi)參照，檢測了14例CML患者22個樣本的融合基因表達水

5、平，并動態(tài)觀察了2例異基因造血干細胞移植(Allo-HematopoieticStemCelTransplantation，AIIo-HSCT)復發(fā)后ber／ablmRNA表達量與臨床療效的關(guān)系。國內(nèi)尚未見類似報道。Bcffabl及GAPDH標準曲線的相關(guān)系數(shù)均為0．999；靈敏度為10-6；14例初診患者的mRNA表達水平范圍為2．8l～145；2例異基因造血干細胞移植后復發(fā)患者的ber／ablmRNA表達水平的改變與臨床疾病進展關(guān)系

6、相一致；CML患者骨髓和外周血bcr／abl表達水平一致。實時定量RT-PCR檢測CML患者的ber／abl融合基因敏感可靠、重復性好，有助于反映白血病細胞負荷、評價療效、判斷疾病預后及指導臨床治療。 第二部分siRNA對bcr/abl融合基因表達的特異性阻斷 RNA干擾技術(shù)是一種由雙鏈RNA誘導的基因沉默現(xiàn)象，它可以降解特定的mRNA，使之無法翻譯成蛋白質(zhì)，從而抑制特定基因的表達。Heidenreich己采用RNAi技

7、術(shù)成功抑制了具有t(8；21)易位的AMLl/MTG8融合基因的表達，mRNA抑制率達50％～80％，AMLl/MTG8融合蛋白也有相應的下降。目前國內(nèi)多通過siRNA表達載體、PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達產(chǎn)生siRNA等進行RNAi研究?；瘜W合成法雖成本昂貴，但特異性好，抑制效率高。我們首先嘗試采用體外化學合成的siRNA進行抑制血液系統(tǒng)惡性腫瘤特定基因表達的相關(guān)研究，國內(nèi)尚未見報道。針對CMLbcr/abl融合基因位點體

8、外化學合成siRNA-S序列，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達ber/abl融合蛋白的K562細胞。比較電穿孔與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染懸浮培養(yǎng)細胞的方法的可行性及轉(zhuǎn)染效率，在體外化學合成的雙鏈siRNA分子5'端標記熒光分子用以確定轉(zhuǎn)染效率，屬國內(nèi)領(lǐng)先。應用實時熒光定量RT-PCR、Westernblots檢測siRNA片段對bcr/ablmRNA和蛋白表達的抑制作用。以具有三個位點突變的siRNA序列(siRNAmut)為對照檢測RNAi作用的特異性。我們觀察到：電

9、穿孔可有效轉(zhuǎn)染siRNA至K562細胞，轉(zhuǎn)染效率在70％以上，高于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(50％～60％)。FAM標記的siRNA不適合應用于電穿孔轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測。SiRNA-S可抑制K562細胞bcr/abl融合基因的表達，雖然轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi)的siRNA會隨轉(zhuǎn)染濃度的增加而增加，但抑制作用不會隨之增加。SiRNA-S的最佳作用劑量為200nM，作用效果短暫，最佳作用時間為48小時。實時熒光定量RT-PCR和Westernbios檢測結(jié)果顯示，si

10、RNA-S可導致ber/ablmRNA下降約67％(轉(zhuǎn)染24小時)和72％(轉(zhuǎn)染48小時)，同時伴隨有ber/abl蛋白表達下降，但對ablmRNA和蛋白的表達無影響。轉(zhuǎn)染siRNAmut對I(562細胞中ber/ablmRNA和蛋白表達均無明顯影響，說明siRNA-S具有高度的序列專一性和有效的干擾活力。國外只有Schen及Wilda等人進行了此方面的相關(guān)研究，我們的實驗結(jié)果與之基本一致。實驗證明，siRNA可特異、有效地抑制bcr/

11、abl融合基因的表達，為研究ber/abl基因功能及其下游信號提供了有效方法；亦為臨床自體造血干細胞移植前造血干細胞的體外凈化提供了頗具前景的方法：siRNA穩(wěn)定、不需要化學修飾、用量低且抑制率高，有可能解決傳統(tǒng)反義核酸技術(shù)基因治療的難題。 第三部分RNAi對1(,562腫瘤細胞生長和增殖的影響 Ber/abl融合蛋白在體外可導致多種細胞系的轉(zhuǎn)化，對維持腫瘤細胞的生長、增殖也有重要的作用。SiRNA阻斷bcr/abl融合

12、基因表達后，K562細胞生物學特性可能會發(fā)生相應改變。應用臺盼藍拒染法和MTT法檢測siRNA對腫瘤細胞增殖的影響，應用AnnexinVoFITC，DNALadder等方法檢測腫瘤細胞的凋亡。轉(zhuǎn)染含點突變的siRNAmut序列為對照檢測其對腫瘤細胞的影響，以空白轉(zhuǎn)染組作對照檢測轉(zhuǎn)染方式的非特異細胞毒性作用。實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA-S的細胞經(jīng)臺盼藍拒染和MTT檢測后，顯示其可短暫抑制K562細胞的增殖；出現(xiàn)典型的DNALadder改變；

13、AnnexinV-FITC染色顯示，K562細胞在轉(zhuǎn)染siRNA-S后死亡與凋亡的比例共為42.10％(24小時)和53.33％(48小時)，其中凋亡比例只占有15.05％(24小時)和19.47％(48小時)。RNAi后，K562細胞死亡比例隨凋亡比例升高而明顯升高，分別為27.05％(24小時)和33.86％(48小時)，而對照組和siRNA-Smut組分別僅為0.63％和4.55％。提示siRNA-S可抑制腫瘤細胞生長；不僅誘導腫

14、瘤細胞的凋亡，還導致腫瘤細胞的死亡。SiRNAmut則無明顯的抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡及死亡的作用。說明siRNA-S對K562細胞增殖的抑制作用特異且有效。Wohlbold等人發(fā)現(xiàn)K562細胞在轉(zhuǎn)染dsRNA48小時后的細胞生物學的變化是凋亡率增高。我們不但觀察到SiRNA-S轉(zhuǎn)染K562細胞后凋亡的增加，而且觀察到K562細胞的死亡也明顯增加。進一步證實bcr／abl融合基因的表達對維持CML腫瘤細胞的分裂和增殖具有重要作用。

15、 第四部分RNAi對bcr/abl相關(guān)下游信號轉(zhuǎn)導分子的影響 具有酪氨酸激酶活性的bcr/abl融合蛋白已被證實與細胞的增殖分化相關(guān)。但腫瘤的發(fā)生發(fā)展的分子機制是相當復雜的，可能涉及了許多細胞信號分子。目前發(fā)現(xiàn)的可能與bcr/abl相關(guān)的信號傳導系統(tǒng)有RAS途徑和JAK/STAT途徑等，siRNA干擾后會通過哪些分子和信號轉(zhuǎn)導通路影響細胞的生物學活性尚不清楚，也未見到相關(guān)文獻報道。JAK／STAT信號途徑在大多數(shù)表達bc

16、r/abl的細胞系中被活化[51,52]，而JAK2和STAT5在CML的發(fā)病機制中起重要作用。故本研究應用Westernblots檢測RNAi干擾前后的JAK2與STAT5表達水平的變化。實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA-S的K562細胞較未轉(zhuǎn)染的細胞相比，JAK2及STAT5蛋白表達水平明顯降低。轉(zhuǎn)染點突變的siRNAmut序列與未轉(zhuǎn)染的細胞比較，JAK2與STAT5蛋白表達水平均無明顯改變。證明siRNA-S抑制bcr/abl融合基因

17、表達后，進一步抑制JAK2/STAT5通路的激活，從而降低腫瘤細胞的抗凋亡作用，進而可能產(chǎn)生其它生物學效應。進一步證實，JAK/STAT是bcr/abl重要的下游信號分子，為CML的基因治療提供了新的潛在治療靶點。 綜上所述，本研究首先建立了可臨床應用的敏感可靠的實時定量RT-PCR檢測bcr/abl融合基因的技術(shù)。應用針對bcr/abl融合蛋白特異、有效的siRNA抑制bcr/abl融合基因的表達。從而抑制了K562腫瘤細胞的