Bcr-abl基因修飾樹突狀細胞疫苗的制備及其誘導CTLs殺傷K562細胞體外實驗研究.pdf

1、研究目的： 1、克隆含慢性粒細胞白血病P210<'bcr/abl>融合蛋白抗原表位的bcr/albl基因片段，連接復制缺陷型重組腺病毒載體，構建pAd-bcr/abl重組體，轉染293A細胞后包裝產生復制缺陷型重組腺病毒Ad-bcr/abl。 2、體外聯合細胞因子rhGM-CSF和rhIL-4由健康人外周血單核細胞誘導培養(yǎng)出DC，從形態(tài)學、細胞免疫表型等方面對DC進行鑒定。 3、轉導了腫瘤抗原基因的復制缺陷

2、型重組腺病毒Ad-bcr/abl感染DC，制備bcr/abl特異性的樹突狀細胞瘤苗。 4、研究DC分別經重組腺病毒載體轉染及bcr/abl多肽負載后，與經IL-2誘導的淋巴細胞共培養(yǎng)，體外誘導產生特異性的CTLs，觀察CTLs對白血病K562細胞的殺傷效應，比較病毒載體轉染與多肽負載DC誘導殺傷白血病細胞的差異。 結果 1、構建pAd-bcr/abl重組腺病毒載體 1．1 構建重組穿梭質粒pAdT

3、rack-CMV-bcr/abl 1．1．1 K562細胞總RNA的提取及RT-PCR擴增目的基因Trizol法提取K562細胞總RNA，測得RNA濃度為998．2ng/ul，OD<,260/280>為1．76。凝膠電泳可見明亮的18S、28S條帶。RT-PCR擴增bcr/abl融合位點兩側堿基序列，擴增產物測得終濃度72ng/ul，1﹪瓊脂糖凝膠電泳接近500bp處可見明亮條帶。 1．1．2 腺病毒穿梭質粒pAdT

4、rack-CMV的小量提取小量提取腺病毒穿梭質粒padTrack-CMV，測得終濃度為34ng/ul，O<,260-280>為1．84。 1．1．3 pAdTrack-CMV-bcr/abl重組穿梭質粒的構建及鑒定雙酶切目的基因和穿梭載體，純化后以T4 DNA連接酶16℃連接過夜。連接產物經卡那霉素篩選，過夜培養(yǎng)后見數百個克隆生長。挑取7個培養(yǎng)克隆提取質粒，雙酶切后產物進行電泳，其中5個克隆均可見接近500bp處及9．2kb兩

5、條帶。以雙酶切得到大小相符兩條片段的重組體質粒為模板，bcr/abl特異性引物PCR擴增，產物電泳亦可見接近500bp處條帶。將雙酶切及PCR鑒定正確的重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-bcr/abl進行DNA序列測定，結果與NCBI Gene Bank所公布bcr/abl融合基因序列(序列號A131466)完全匹配，未發(fā)生堿基缺失或突變。 1．2 重組腺病毒質粒pad-bcr/abl的構建及鑒定 重組穿梭質粒

6、線性化后與病毒骨架質粒共轉化大腸桿菌BJ5183進行同源重組，經卡那霉素篩選，過夜培養(yǎng)見數十余個克隆生長。挑取13個培養(yǎng)克隆提取質粒，0.8﹪瓊脂糖凝膠電泳后選取大小大于病毒骨架質粒的轉化克隆并進一步用Pac Ⅰ酶切，產物電泳見到一條3.0kb的小片段及一條約30kb大片段的即為重組腺病毒質粒pAd-bcr/abl。 1．3 去內毒素中量提取重組腺病毒質粒pAd-bcr/ablpAd-bcr/abl重組腺病毒質粒去內毒素中量提

7、取，測得濃度為600ng/ul。 2、重組腺病毒Ad-bcr/abl的包裝重組腺病毒質粒轉染293A細胞后，可見轉染后24h即有GFP表達，量較少，以后逐漸增多，約在第5d時熒光表達量最多。液氮/37℃反復凍融獲得的病毒液重復感染293A細胞后，隨放大次數的增加，病毒滴度逐漸增高，顯微鏡下見感染后細胞呈現明顯的細胞病變效應(CPE)，胞體變圓并逐漸從壁上脫落。倒置熒光顯微鏡下可見到綠色熒光蛋白(GFP)大量表達。 3

8、、重組腺病毒Ad-bcr/abl中目的基因的檢測及病毒滴度測定 3．1 PCR檢測重組腺病毒Ad-bcr/abl中目的基因第7代病毒裂解液和正常培養(yǎng)293A細胞上清為模板進行PCR擴增，產物進行1﹪瓊脂糖凝膠電泳，可見病毒液樣本中均在接近500bp處有明亮條帶，而對照樣本未見相應條帶。 3．2 病毒滴度測定取10<'-5>稀釋度的293A細胞進行滴度測定，細胞計數為8.8×10<'5>，GFP表達率16﹪。病毒滴度(

9、pfu/ml)=(細胞總數×GFP表達率×病毒稀釋度)/0.7=2.0×10<'10> 4、外周血來源樹突狀細胞的培養(yǎng)及鑒定。 4.1 形態(tài)學觀察倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，培養(yǎng)24h后可見貼壁細胞呈集落性生長，第3-5d見部分細胞懸浮，體積增大，圓形或不規(guī)則形，表面有毛刺樣或偽足樣凸起。第7d，大部分細胞呈懸浮生長，體積明顯增大，表面?zhèn)巫銟蛹皹渲油蛊疠^前增多且更加明顯。 4.2 流式細胞儀檢測DC表面標記

10、培養(yǎng)第3d DC表面標記CD14為77.1﹪、CD40為98﹪、CD80為22﹪、CD83為14.2﹪、CD86為98.5﹪；培養(yǎng)第8d的DC表面標記CD14為5.58﹪、CD40為68.6﹪、CD80為26.5﹪、CD83為23﹪、CD86為98.6﹪。單核細胞特征性標志CD14接近陰性，而成熟DC的標志CD83上升至23﹪，且高表達CD40、CD86等共刺激分子，表明經細胞因子誘導后，大部分單核細胞轉變成了樹突狀細胞。 5

11、、重組腺病毒轉染DC構建bcr/abl特異性樹突狀細胞瘤苗重組腺病毒轉染培養(yǎng)第6d的DC，轉染后24h熒光倒置顯微鏡下可見到被轉染的DC內表達綠色熒光蛋白(GFP)，且48h后熒光較前增多，轉染效率約為50～60﹪。收集重組腺病毒轉染的DC，即為構建的bcr/abl特異性樹突狀細胞瘤苗。 6、bcr/abl特異性樹突狀細胞疫苗誘導CTLs體外殺傷K562細胞在效靶比分別為40：1和20：1時，實驗組A誘導的CTLs對K562細

12、胞的殺傷效率分別為47.62﹪±4.70﹪和47.50﹪±1.64﹪；實驗組B對K562細胞的殺傷效率分別為25.78﹪±4.43﹪和24.56﹪±6.30﹪；空白對照組對K562細胞的殺傷效率分別為5.72﹪±1.30﹪和4.48﹪±1.62﹪。采用單因素方差分析進行檢驗，在任一固定效靶比下，實驗組A、實驗組B及空白對照組兩兩比較，差別均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；對實驗組A、實驗組B及空白對照組分別在不同效靶比下的殺傷效率作兩兩

13、比較，差別不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實驗結果表明，負載了bcr/abl腫瘤抗原的DC能顯著增強CTLs對K562細胞的殺傷作用，而以重組腺病毒為載體介導bcr/abl基因片段轉導Dc制備的瘤苗又較多肽負載的DC瘤苗具有更加顯著的誘導CTLs殺傷慢粒白血病K562效率細胞的作用。 結論 1、克隆bcr/abl基因片段，成功構建了pAd-bcr/abl復制缺陷型重組腺病毒表達載體。 2、陽離子脂質體法介

14、導pAd-bcr/abl重組體轉染293A細胞，包裝產生高滴度的復制缺陷型重組腺病毒Ad-bcr/abl。 3、通過聯合應用細胞因子rhGM-CSF和rhIL-4由健康人外周血單核細胞誘導培養(yǎng)出具有典型樹突狀形態(tài)特征的DC；流式細胞儀檢測表達成熟DC表面標記及高水平的共刺激分子。 4、用轉導了腫瘤抗原基因的復制缺陷型重組腺病毒Ad-bcr/abl轉染DC，成功制備出bcr/abl特異性的樹突狀細胞瘤苗。 5