慢病毒介導(dǎo)強(qiáng)制泛素化HBcAg基因修飾小鼠髓源性樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng).pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的慢性感染仍然危害人類健康，全球大約有3.5億人感染HBV，部分患者最終進(jìn)展為肝硬化、肝細(xì)胞癌。目前尚無有效的方法徹底清除患者體內(nèi)的乙肝病毒。特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)在控制HBV的感染中起關(guān)鍵性作用，通過抗原刺激產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)是清除慢性HBV感染者體內(nèi)病毒的一個(gè)有效途徑。
　　 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubi

2、quitin-proteasome system，UPS)是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)依賴ATP的高選擇性蛋白質(zhì)降解體系，它由泛素(ubiquitin，Ub)、泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)、泛素-蛋白連接酶(ubiquitin-protein ligase，E3)、26S蛋白酶體及去泛素化酶(deubiquitina

3、tingenzyme，DUB)等組成。泛素化的蛋白被蛋白酶體復(fù)合物識(shí)別后降解為若干小肽段，可以與MHCⅠ類分子結(jié)合被抗原提呈細(xì)胞識(shí)別，誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)。諸多研究表明，將泛素和抗原蛋白連接可顯著促進(jìn)抗原蛋白在細(xì)胞內(nèi)的降解、遞呈，增強(qiáng)抗原誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
　　 樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是目前發(fā)現(xiàn)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，它通過吞噬、表達(dá)、遷移等一系列過程，啟動(dòng)體內(nèi)的免疫系統(tǒng)。已有研究表明，通過各種途徑將DC

4、負(fù)載病毒或腫瘤抗原，可促進(jìn)抗原的加工提呈，有效激活抗原特異性CTL應(yīng)答。
　　 本研究通過構(gòu)建強(qiáng)制泛素化乙肝病毒核心抗原(Ub-HBcAg)重組慢病毒，體外轉(zhuǎn)染小鼠骨髓源性DC，觀察慢病毒(lentivirus，LV)介導(dǎo)的Ub-HBcAg基因修飾DC體外誘導(dǎo)抗原特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)共分三部分：(1)Ub-HBcAg基因重組慢病毒(LV-Ub-HBcAg)的構(gòu)建及其表達(dá)；(2)LV-Ub-HBcAg誘導(dǎo)小鼠髓源性樹突狀細(xì)

5、胞成熟及在T淋巴細(xì)胞增殖中的作用；(3)LV-Ub-HBcAg修飾DC誘導(dǎo)CTL反應(yīng)的體外研究。
　　 第一部分Ub-HBcAg基因重組慢病毒的構(gòu)建及其表達(dá)
　　 目的：構(gòu)建Ub-HBcAg融合基因的慢病毒載體，包裝成重組慢病毒并觀察目的基因在293T細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 方法：PCR擴(kuò)增Ub-HBcAg融合基因，插入到慢病毒骨架質(zhì)粒pWPXLd中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pW-Ub-HBcAg。將重組的質(zhì)粒pW-Ub-H

6、BcAg和慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜質(zhì)粒PMD2.G用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得攜帶Ub-HBcAg基因的重組慢病毒LV-Ub-HBcAg，并通過Western blot檢測(cè)目的基因在293T細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：強(qiáng)制泛素化HBcAg融合基因的慢病毒載體經(jīng)測(cè)序證實(shí)目的基因序列及插入方向均正確，熒光倒置顯微鏡觀察到轉(zhuǎn)染病毒細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)的表達(dá)，West

7、ern blot檢測(cè)到目的蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了攜帶強(qiáng)制泛素化HBcAg融合基因的慢病毒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后能夠穩(wěn)定表達(dá)目的基因。
　　 第二部分LV-Ub-HBcAg誘導(dǎo)小鼠髓源性樹突狀細(xì)胞成熟及在T淋巴細(xì)胞增殖中的作用
　　 目的：觀察LV-Ub-HBcAg誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的小鼠髓源性樹突狀細(xì)胞成熟及對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的作用。
　　 方法：體外分離培養(yǎng)近交系Balb/c小鼠髓源

8、性DC，加重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-simulating factor，GM-CSF)，重組白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-4培養(yǎng)5d，再加入LV-Ub-HBcAg，LV-HBcAg或LV誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟，同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照LPS組。流式細(xì)胞儀測(cè)定DC表面分子表達(dá)，ELISA法測(cè)定DC培養(yǎng)上清中IL-12的水平，Cell Counting Kit-8(CC

9、K8)試劑盒檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：體外成功誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠髓源性DC，LV-Ub-HBcAg轉(zhuǎn)染DC效率達(dá)56.1％，能明顯上調(diào)DC表面分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ類分子表達(dá)，能促進(jìn)DC分泌IL-12(128.08±15.09)pg/ml，且明顯高于LV-HBcAg組分泌的量(P<0.01)。LV-Ub-HBcAg誘導(dǎo)DC刺激T細(xì)胞增殖能力顯著高于LV-HBcAg組。
　　 結(jié)

10、論：LV-Ub-HBcAg能有效轉(zhuǎn)染DC，促進(jìn)DC分化、成熟，上調(diào)表面共刺激分子表達(dá)，增強(qiáng)DC刺激T細(xì)胞增殖及分泌IL-12能力。
　　 第三部分 LV-Ub-HBcAg修飾DC誘導(dǎo)CTL反應(yīng)的體外研究
　　 目的：探討慢病毒載體介導(dǎo)的Ub-HBcAg基因修飾DC體外誘導(dǎo)CTL反應(yīng)。
　　 方法：體外分離培養(yǎng)小鼠髓源性DC，加入重組慢病毒刺激DC成熟并與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，ELISA檢測(cè)T淋巴細(xì)胞上清中IL-2、I

11、L-4、IL-10和干擾素(interferon，IFN)-γ的分泌水平，流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子水平。
　　 結(jié)果：LV-Ub-HBcAg刺激的DC能有效促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，其中IL-2(436.5±44.6 pg/ml)和IFN-γ(144.6±15.6 pg/ml)明顯高于LV-HBcAg組中IL-2(367.8±59.4 pg/ml)和IFN-γ(102.1±13.3 pg/ml)分泌。流式細(xì)胞儀檢測(cè)LV-Ub